一株拮抗放线菌的分类鉴定与发酵条件优化试验

李丹 陈静 （山东宝来利来生物工程股份有限公司 泰安 271000）



一株拮抗放线菌的分类鉴定与发酵条件优化试验

李丹 陈静 （山东宝来利来生物工程股份有限公司 泰安 271000）

采用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16SrDNA 序列分析方法，对本实验室筛选到的一株放线菌Fyss进行分类鉴定，同时对其发酵液的抑菌活性进行了研究。结果表明，菌株Fyss为链霉菌属，其发酵液对革兰氏阳性细菌具有抑制作用，适宜发酵条件为发酵培养基最适初始pH为8.0，培养时间5d，培养温度28℃，培养转速210rpm。

放线菌 分类鉴定 发酵液 发酵条件

现代畜禽集约化养殖中，动物养殖密度高、空间小，动物舍内外微生物气溶胶浓度高[1]，舍内尘埃、微生物、有害气体的增加导致畜禽舍空气污染。这些物质直接刺激动物的呼吸器官，容易引起一些条件性致病病原体的感染[2]，抑制机体的免疫力，影响动物健康和生产性能的发挥，也使禽舍人畜共患病病原体向周边环境传播，给人畜带来感染威胁[3]。传统改善环境的方法是喷洒消毒剂等方式，不仅对畜禽呼吸道黏膜产生刺激，特别是对幼龄阶段、免疫前后会产生负面影响，而且容易使环境中的病原微生物产生耐药性。

本项目从畜禽舍周边土壤采样，筛选出能够抑制畜禽舍常见病原微生物的菌株，对其进行培养、形态观察、生理生化鉴定以及16S rDNA 序列分析，同时对其进行液体深层发酵并对其发酵液的抑制病原菌活性进行了研究，为开发畜禽舍新型、高效、无毒副作用的新型微生态环境改良剂提供了基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Fyss 采集泰安市畜禽舍周边土壤，实验室阴干后进行放线菌的筛选分离。

1.1.2 供试菌 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本研究院菌种保藏中心提供。

1.1.3 培养基 高氏一号培养基

1.1.4 主要仪器 PCR仪，扫描电镜，超净工作台，振荡培养箱，高压灭菌锅等。

1.2 菌株的初步鉴定

1.2.1 形态特征观察 采用插片法[4]，观察基内菌丝的形态特征。

1.2.2 培养特征与生理生化特性 将菌株接种到培养基上，于28℃下恒温培养，观察并记录菌株的培养特征与生理生化特性[5, 6]。

1.3 16S rDNA PCR扩增

（1）菌体总DNA 的提取参照Hopwood[7]等方法提取菌体总DNA。（2）16SrDNA PCR扩增及扩增产物的纯化、测序：菌种鉴定采用16SrDNA保守序列的PCR鉴定法，细菌16SrDNA扩增的引物序列为：上游：5’-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游：5’-AAGGAGGTGA TCCAGCCG CA-3’，序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为：dNTP Mixture 4μl，5×PrimeSTAR Buffer 10μl，上下游引物各0.6μl，基因组模板约0.8μl，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.6μl，用无菌去离子水补充至50μl。PCR循环参数为：95℃ 5min；94℃ 1min，58℃ 15s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min。将PCR反应产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果应用DNAStar软件下的MegAlign子软件进行分析。

1.4 系统进化树的构建

将所得到的16SrDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行相似性搜索，选取同源性较高的16SrDNA序列作为参比对象，用DNAman软件进行多序列比对，构建系统进化树。

1.5 抑菌活性的测定

以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯法[8]抑菌活性以抑菌圈直径来表示。

1.6 发酵条件对发酵液抑菌活性的影响

采用摇瓶发酵培养，观察培养基初始pH、发酵时间、发酵温度、培养转速对放线菌发酵液抑菌活性的影响。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 形态特征 在高氏1号固体培养基，于28℃培养96h可以观察到Fyss的菌落白色，呈圆形，表面可见同心圆结，边缘整齐，表面干燥。培养7d后，气生菌丝和基内菌丝均很丰富，颜色一致，基质上产生黑色色素。图1中可以观察到基内菌丝交织紧密，形成长主径，不断裂。

图1 Fyss菌株的光学显微镜照片

2.1.2 生理生化特征 Fyss菌株能使淀粉水解、明胶液化、纤维素不水解、牛奶凝固而不胨化；产生硫化氢、不还原硝酸盐；可利用半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、肌醇、蔗糖、棉子糖作为碳源生长，不能利用果糖、木糖、阿拉伯糖。

2.1.3 DNA全序列的相似性比较和系统发育分析 系统发育树的构建菌株Fyss的rRNA序列在NCBI数据库比对分析后显示，与菌株EF063470具有较高同源性。从GenBank中调取相关的16SrRNA 序列，采用DNAman等软件对菌株进行系统发育分析，构建系统进化树(图)。从菌株的16S rRNA序列聚类分析结果来看，菌株Fyss与亲缘关系最密切，结合以上菌体的形态、生理生化特征把菌株初步鉴定为链霉菌属

2.2 放线菌Fyss的抑菌活性

应用基础发酵条件培养的放线菌Fyss，在第3天检测其发酵液的抗菌活性，测得其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为(22±2.0)mm，而对大肠杆菌和沙门氏菌均没有抑制作用。因此发酵条件优化实验以金黄色葡萄球菌作为指示菌。

2.3 发酵条件对发酵液抑菌活性的影响

2.3.1 发酵培养基初始pH对发酵液抑菌活性的影响

图2 初始pH值对Fyss菌株发酵液抑菌活性的影响

由图2可见，不同初始pH对Fyss菌株发酵液生物活性有一定影响，初始培养基偏碱性时抑菌活性较好，pH8~9时抑菌活性趋于稳定。

2.3.2 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响

图3 取样时间对Fyss菌株发酵液抑菌活性的影响

由图3可见，不同发酵时间Fyss菌株发酵液对金黄的葡萄球菌的抑菌活性有影响，随着发酵时间的延长，抑菌活性有增高趋势，5d抑菌活性最高。

2.3.3 发酵温度对发酵液抑菌活性的影响

图4 温度对Fyss菌株发酵液抑菌活性的影响

由图4可以看出，随着发酵温度的升高，Fyss菌株发酵液抑菌活性有增加，但增加缓慢，在28~36℃之间变化不明显，因此Fyss菌株发酵温度以28℃为宜。

2.3.4 培养转速对发酵液抑菌活性的影响

图5 转速对Fyss发酵液抑菌活性的影响

由图5可见，培养转速对Fyss发酵液抑菌活性有影响，转速较高时，抑菌活性增强，转速180rpm的发酵液抑菌圈直径明显高于150rpm，转速210rpm时抑菌活性最高。

经对其发酵条件优化试验筛选出其适宜发酵条件为发酵培养基最适初始pH为8.0，培养时间5d，培养温度28℃，培养转速210rpm。发酵条件的优化及发酵液预处理为产品复配及工业生产奠定了基础。

3 结语

（1）结合菌株的形态和培养特征、生理生化试验以及16S rDNA 序列的同源性比较，初步判定放线菌Fyss为链霉菌)。（2）菌株Fyss发酵液对革兰氏阳性细菌具有的抑制作用，适宜发酵条件为发酵培养基最适初始pH为8.0，培养时间5d，培养温度28℃，培养转速210rpm。

[1] 胡庆轩. 大气细菌粒子浓度的时间分布特征及最佳采样时间的研究[J]. 卫生研究. 1997,26(4): 226-231.

[2] Mehlhorn G,Chai T j .Lehrbuch der Tierhygiene[J] . 2. Aufl 2002 ,In Drucklegung.

[3] 钟召兵等. 鸡舍环境金黄色葡萄球菌气溶胶产生及其传播的REP2PCR鉴定[J]. 畜牧兽医学报. 2008 ,39 (10): 1395-1401.

[4] 沈萍, 范秀容, 李广武. 微生物学实验[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999.

[5] 中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 1975.

[6] 阎逊初. 放线菌的分类和鉴定[M]. 北京: 科学出版社, 1992.

[7] Hopwood D A, Bill M J, Chater K F et al, 1985. Genetic manipulation of Streptomycetes: a laboratory manual. inpreparation of chromosomal, plasmid and phage DNA,Norwich: F. Crowe & Sons Ltd, 79-80.

[8] 刘冬梅, 李理等. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究与开发, 2006(3): 110-111.

（2011–06–14）

S852.61+9

A

1007-1733(2011)08-0007-03