鸡脾脏转移因子的理化性质鉴定及对肉仔鸡应用效果的研究

车国喜 李德龙 耿群 臧喜龙 刘立涛 李超 任庆海 石迎 （山东农业大学动物科技学院 271018 泰安六和祝阳鸡场 山东莘县金鑫畜禽有限公司）



鸡脾脏转移因子的理化性质鉴定及对肉仔鸡应用效果的研究

车国喜①李德龙①耿群②臧喜龙③刘立涛①李超①任庆海①石迎①（①山东农业大学动物科技学院 271018 ②泰安六和祝阳鸡场 ③山东莘县金鑫畜禽有限公司）

本文对山东莘县金鑫畜禽有限公司研发提取的鸡脾脏TF进行理化性质鉴定、增强鸡体免疫功能和生产性能、体内外抗病毒及体外抗菌试验。结果表明，该鸡脾脏TF主要成分为多肽，理化性质鉴定、无菌试验和安全试验结果均符合脾脏TF质量标准，在鸡胚和BHK细胞上有一定的抗病毒效果，直接抗菌作用不明显。临床药效试验表明该TF可以显著提高肉鸡的生产性能和免疫机能。

鸡 脾脏 转移因子 现化性质

转移因子(TF)是体内有免疫活性的T淋巴细胞所释放的能够转移免疫致敏信息的因子，能特异性地将供体细胞免疫功能转移给受体动物，非特异性地增强受体动物免疫功能，是一种新型的免疫激发剂[1]。TF广泛用于人与动物病毒病、细菌病、真菌病、寄生虫病等的防治，尤其是近年来鸡脾脏TF因其资源丰富、效价高、效果好，其开发研究与临床应用引起人们的高度重视[1]，对鸡脾脏TF的制备方法有了很大改进，并且制定了质量标准。

1 材料与方法

1.1 理化性质鉴定

1.1.1 蛋白质定性试验 按参考文献[2,6]配制25%磺基水杨酸溶液于试管内，逐滴加入待检的鸡脾脏TF，观察有无白色沉淀物出现。

1.1.2 核糖含量测定 按参考文献[3,6]准确配制0.31mol/L三氯醋酸、0.61mol/L三氯醋酸、0.019mol/L三氯化铁-盐酸溶液、1%二羟基甲苯(苔黑酚)和标准核糖溶液。用移液器准确量取转移因子待检品1ml于试管中，加入0.61mol/L三氯醋酸1ml，置沸水浴中水解15min。然后吸取水解液0.4ml，加0.31ml/L三氯醋酸1.6ml和1%二羟基甲苯2ml，混匀，再置沸水浴中加热30分钟，冷却至室温，在650nm波长测定OD值。同时准确吸取核糖标准液1ml，加0.31mol/L三氯醋酸1ml，混匀，其余操作同样品，并用去离子水做为空白对照。待测样品设3个重复。

1.1.3 多肽含量测定 按参考文献[3]配制0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250和 0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml牛血清血蛋白溶液，用于制作标准曲线。待测样品设3个重复。

1.1.4 紫外分光光度法检测核苷酸含量 紫外分光光度仪分别在260nm和280nm波长下，检测该鸡脾脏TF的吸光值，以灭菌去离子水作为对照。

1.1.5 无菌试验 按《中国生物制品规程》中生物制品无菌试验规程进行。无菌制备琼脂培养基，接种待检的鸡脾脏TF，放置到37.C培养48h观察。

1.1.6 安全试验 按《中国生物制品规程》中生物制品安全试验规程进行。取4只小白鼠，每只腹腔注射待检样品0.1ml，观察7d.。

1.1.7 体外抗病毒试验 （1）体外培养细胞上抗病毒试验。将BHK养成单层后，分组：只接种NDV组，接种NDV和高剂量的转移因子组，接种NDV和中剂量的转移因子组，接种NDV和低剂量的转移因子组和空白对照组，观察并记录不同组细胞死亡50%的时间。（2）鸡胚接种抗病毒试验。取9~11日龄SPF鸡胚50枚，分为5组：只接种NDV组，接种NDV和高剂量的转移因子组，接种NDV和中剂量的转移因子组，接种NDV和低剂量的转移因子组和空白对照组，观察不同组鸡胚死亡数。

1.1.8 体外抗菌性试验 分离大肠杆菌，用临床常用抗大肠杆菌药进行药敏试验，筛选一种效果最好的抗生素与鸡脾脏转移因子进行抗菌性试验。设单独抗生素组、单独鸡脾脏TF组、抗生素加鸡脾脏TF高剂量组、抗生素加鸡脾脏TF中剂量组和抗生素加鸡脾脏TF低剂量组。

1.2 临床应用效果试验

1.2.1 试验时间与地点 时间：2011年4月4日至2011年5月17日，共计43d。地点：泰安市岱岳区祝阳商品鸡场。

1.2.2 试验分组及用药程序 将来自同一父母代种鸡场同批次的1日龄“AA”商品代鸡雏13000只，分配到6栋鸡舍中，每栋鸡舍作为1个试验组，A、B、C、D、E为投放药品试验组，F为空白对照组。

表1 实验分组及处理情况(羽/瓶)

前2次用药旨在降低雏鸡的上栏应激，1、2日龄投放。中间3次用药旨在增强疫苗效价，及减小小窗口期的应激，在防疫的前1天投放。最后1次为增强大窗口期的鸡体免疫能力。以上均在下午投放，兑水集中3h饮水使用。

1.2.3 饲养管理与疫苗接种 免疫程序：9日龄免疫新支二联苗，2倍量点眼滴鼻；16日龄用法氏囊中等毒力疫苗2倍量饮水。饲养管理均按“AA肉仔鸡饲养管理手册”提供的技术资料进行，舍内采取网上平养，自由采食，自动供水，免疫接种按照公司规定的接种程序进行。

1.2.4 采血及抗体检测 在16、23、31、39四个日龄实验组和对照组分别随机抽取30只鸡用一次性无菌注射器采血，用血凝和血凝抑制试验检测NDV和禽流感H9抗体。

1.2.5 生产指标的记录和测定 每天记录各组鸡只死亡、饲料消耗、药物防疫情况并整理日报表。在21、42日龄时，所有的试验、对照鸡都按3%称重并详细记录称重结果，评估日增重水平。分析在21、42日龄时，所有的试验、对照鸡的成活率情况。

1.2.6 数据处理 各数据采用SPSS17.0软件进行方差分析和LSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 理化性质

2.1.1 蛋白质定性试验 未观察到白色沉淀，说明该鸡脾脏TF提取物不含有蛋白质。

2.1.2 核糖含量测定 该鸡脾脏TF核糖含量检测吸光度平均值为0.513，换算成每毫升鸡脾脏TF含量平均值为85.4μg/ml。

2.1.3 多肽含量 该鸡脾脏TF多肽含量检测吸光度平均值为0.036，计算得出多肽含量为96.012μg/ml。

2.1.4 核苷酸含量 用紫外分光光度法测定的该鸡脾脏TF在260nm下吸光度平均值为2.737，计算得出核苷酸含量为136.85μg/ml。在280nm下吸光度平均值为2.723。计算OD260/ OD280 的比值为1.0，根据紫外吸收特征，表明该鸡脾脏TF的主要成分是多肽。

2.1.5 安全试验 4只小白鼠均未出现死亡，注射局部也未发现充血、肿胀、结痂等病理反应。

2.1.6 无菌试验 普通琼脂培养基上未见细菌生长。

2.1.7 细胞上抗病毒试验

表2 接毒后半数细胞半数死亡时间

结果表明：单独接种NDV组与NDV和低剂量TF混合组没有差异，与NDV和中剂量TF组稍有差异但不明显，与NDV和高剂量TF组差异明显，各组均与阴性对照差异明显。说明高剂量TF对病毒的复制起到一定的抑制作用，而中、低剂量效果不明显。

2.1.8 接种鸡胚抗病毒试验

表3 接毒后鸡胚死亡情况

结果表明：低剂量的TF组在鸡胚内未表现抗病毒作用，中、高剂量的TF组可使鸡胚死亡数明显减少，具有明显的抗病毒作用；高剂量TF组未见鸡胚死亡，说明该制剂对鸡胚无毒副作用。

2.1.9 体外抗菌试验 各组抑菌圈无明显差异，说明该制剂体外直接抗菌作用不明显。

2.2 临床应用效果

2.2.1 使用鸡脾脏TF对NDV抗体滴度的影响 结果显示，在16日龄前各组之间的NDV抗体滴度差异不显著(P>0.05)。16~31日龄A组的NDV抗体，明显高于对照未用药组(P<0.01)。31日龄后A、B、C组差异不显著，却与对照组差异显著(P<0.05)，其中C组与对照组差异极显著。表明免疫时配合使用转移因子可以提高免疫的抗体滴度，在20日龄后效果更明显，400羽/瓶和800羽/瓶是效果较好，见表4。

表4 使用TF对ND抗体滴度的影响 (log2)

注：*每列中字母相同者表示差异不显著 (P>0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2.2 使用鸡脾脏TF对AIV-H9抗体滴度的影响 结果显示，由于全程饲养过程没有进行AIV-H9的免疫，所以抗体水平随着日龄的增长逐渐降低，但是没有发病，并且23日龄以后试验组与对照组抗体水平差异显著，其中A、B、C效果较好。

表5 使用TF对AIV-H9抗体滴度的影响 (log2)

注：*每列中字母相同者表示差异不显著 (P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.3 使用鸡脾脏TF对大肉食鸡日增重及成活率的影响

表6 使用鸡脾脏TF对大肉食鸡日增重及成活率的影响

从日增重来看，A组最好，D组次之，F组最差；从成活率来看，21日龄时C组最高，D组最差，对照组较其他实验组低；42日龄时C组成活率最高，D组最差，对照组较其他试验组成活率低。从日增重来看，投药组都比对照组增重快，但并不是随用药梯度递增，在不考虑非人为因素的条件下，较有利于鸡群生长的剂量为800羽/瓶和400羽/瓶，其他剂量效果次之。从2个阶段的成活率来看，排除D组弱雏较多的情况来看，试验组的成活率普遍高于对照组，其中A组和C组明显高于其他试验组。说明本生物制剂对成活率及机体免疫力有明显的提高作用。考虑后期体重增加，最优剂量为400羽/瓶。

2.2.4 成本核算 用药成本在0.15元/只鸡，本试验中均提高成活率在2.476%以上，按每只鸡均重2.5kg，肉价9.8元/kg计算，100只鸡增加生产效益：100×0.02476× 2.5×9.8=60.66元，减去用药成本100×0.15=15元，净增益：60.66-15=45.66元，即每只鸡增加收益0.4566元。

3 结论

本试验对该鸡脾脏TF提取物的理化性质鉴定结果表明：鸡脾脏TF提取物不含有蛋白质，主要成分为多肽，还含有核苷酸、核糖成分，无菌试验和安全试验结果均符合质量标准，在鸡胚和BHK细胞上有一定的抗病毒效果，但直接抗菌作用不明显。

由于临床药效试验样本量较大、随机抽样和饲养规范统一，试验数据可靠性强。鸡脾脏TF对机体免疫机能的影响的试验结果表明：免疫时配合使用转移因子，可以提高免疫的抗体滴度，在20日龄后效果更明显，400羽/瓶和800羽/瓶是效果较好。从对生产指标的影响角度上来说，该液态转移因子的使用显著提高了鸡群的平均日增重和成活率，在20日龄以后效果更显著，400羽/瓶和800羽/瓶效果较好。因此临床使用时20日龄前使用剂量为800羽/瓶，后期使用剂量为400羽/瓶.

综上，该鸡脾脏转移因子为多肽类物质，无菌无毒性，体外有一定抗病毒效果，临床上对大肉食鸡免疫抗病机能及生产性能均有较好的增强作用，显著增加养鸡收益，为鸡脾脏转移因子在养鸡业上的推广提供科学依据。

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（2011–06–01）

S818.9

A

1007-1733(2011)08-0002-03