液相色谱/串联质谱法检测猪肉中三种化学物质的残留试验

2011-11-12王秀颖许永国周大庆王维霞谢丽霞山东诸城绿安检测有限公司262200

山东畜牧兽医 2011年8期

王秀颖许永国周大庆王维霞谢丽霞（山东诸城绿安检测有限公司 262200）

王秀颖许永国周大庆王维霞谢丽霞（山东诸城绿安检测有限公司 262200）

本试验建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺残留的方法。样品中的药物残留采用0.2mol/L pH5.2的乙酸铵缓冲液提取，加入β－葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，提取液经混合型阳离子交换柱进行净化，液相色谱－串联质谱测定，内标法定量。克伦特罗0.05µg/kg；莱可多巴胺、沙丁胺醇0.2µg/kg。回收率均大于88%。

猪肉克伦特罗沙丁胺醇莱克多巴胺残留

河南省部分地区“瘦肉精”事件曝光后，引起国家各级部门高度重视，也使广大人民群众对食品安全的问题极为关注。“瘦肉精”是β-肾上腺素兴奋剂，是一种人体平喘药物。将它添加在饲料里可以提高饲料的利用率、加快动物生长速度、使猪的瘦肉率提高近10%，因此有“瘦肉精”之称，而造成人体中毒的主要是β-肾上腺素兴奋剂中的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇。本试验建立了高效液相色谱-串联质谱同时检测猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺残留的方法。本方法能快速、高灵敏、同步检测沙丁胺醇，莱克多巴胺与克伦特罗残留含量。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 Aglient 1200/6430高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪；菲罗门Luna-C18色谱柱(150× 2.00mm，3.0μm)；北京时代北利GTR16-2高速冷冻离心机；上海泉岛HFC-12氮吹仪；WatersMCX固相萃取柱；SUPELCO SPE固相萃取装置；梅特勒pH酸度计；MILLI-Q超纯水仪；SIGMAβ－葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶；乙腈、甲醇、正已烷、乙酸乙酯均为色谱纯。

1.2 仪器条件液相色谱条件：流动相：乙腈—0.1%甲酸水，梯度洗脱；流速：0.3ml/min；柱温：40℃；进样量：10µl；质谱条件：电喷雾离子源；雾化气压力：45psi；干燥气温度：350℃；干燥气流速：11L/min；正离子扫描；多重反应监测(MRM)。

1.3 标准溶液的配制分别称取适量克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品甲醇溶解甲醇制成标准储备液(100µg/ml)；分别称取适量D9-克仑特罗、D3-沙丁胺醇、D3-莱克多巴胺用甲醇制成标准内标储备液(100µg/ml)；

1.4 样品的提取与净化称取约10.0g试样，放入100ml离心管中，添加混合同位素内标物，加入乙酸铵缓冲液(0.2mol/L)20ml，均质1min，然后加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50µl，充分振荡混匀，在恒温振荡水浴中37℃酶解16h。以10000r/min离心10min，收集上清液于另一50ml离心管中，加入10ml正己烷，充分混匀，然后以10000r/min离心10min，弃去正己烷层，用滤纸过滤下层溶液于另一50ml离心管中。依次用5ml甲醇、5ml水对MCX柱进行预处理，然后将提取液加载在MCX柱上，再依次用5ml水、5ml50%甲醇和5ml正己烷洗柱，弃去淋洗液；真空抽干5min，用6ml洗脱液(50%乙酸乙酯：45%甲醇：5%氨水)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在45℃下氮气流吹干，加入1ml乙腈：0.1%甲酸水(1+9)溶液溶解残渣，过0.22µm滤膜，进行HPLC-MS/MS测定分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化为使组分获得好的分离效果，及在分析样品时减少杂质的干扰，本试验进行了梯度优化选择。对比试验结果确定为流动相：A：乙腈、B：0.1%甲酸水。

表1 试验选择的梯度 (min, %)

分离效果如图1。

图1 全扫描总离子流色谱

2.2 质谱条件的优化为得到响应高且稳定的信号，避免干扰和提高目标物的灵敏度，进行了质谱条优化。所选择的离子对与标准基本一致，发现莱克多巴胺定性离子对302.2/284.3样品基质干扰严重，试验对比定性离子对302.2/107.1效果较好。

表2 对比定性离子对效果

2.3 提取与净化的优化参照行业标准及文献报道，对3种浓度的乙酸铵缓冲液提取液(0.02、0.2、2mol/L)和2种固相萃取柱(MCX及SCX)做了对比实验，结果表明回收率随提取液浓度升高而升高，但高浓度提取液较难通过固相萃取柱。选用0.2mol/LpH5.2的乙酸铵缓冲液提取，WatersMCX固相萃取柱萃取。净化效果好回收率高。

2.4 线性范围与检测限 0.2、0.5、1、2、5、10ng/ml的标准工作曲线线性关系良好，莱克多巴胺回归方程为y=1.7063×-0.0526，相关指数R2=0.9999；克仑特罗回归方程为y=1.8461×-0.0202，相关指数R2=0.9999；沙丁胺醇定回归方程为y=1.6901×-0.0572，相关指数R2= 0.9999；本试验的方法定量检出限均为：克伦特罗0.05µg /kg；莱克多巴胺、沙丁胺醇0.2µg/kg。

2.5 准确度和精密度以猪肉做添加回收试验，样品中添加浓度为0.2µg/kg、0.5µg/kg、1µg/kg.每个浓度做了6次平行试验。