八角茴香油的提取工艺及抗菌、抗氧化性作用

付敏东，李成欢

汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东韶关 512026

八角茴香油的提取工艺及抗菌、抗氧化性作用

付敏东，李成欢

汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东韶关 512026

目的：研究八角茴香油的提取工艺、抗菌、抗氧化作用。方法：采用95%乙醇做溶剂,通过正交试验、体外抑菌试验、对DPPH-自由基清除能力试验分别对八角中的八角茴香油的提取工艺、抑菌作用、自由基清除能力等进行研究。结果：试验结果表明，八角茴香与95%乙醇溶液比为1∶6，虹吸次数为6次，浸泡时间为2.4 h是八角茴香油的较佳提取工艺。八角茴香油浓度在15.62～62.50 mg/L时对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉菌等呈中度敏感；对DPPH-自由基的清除能力随着浓度的增加而增强。结论：采用乙醇回流提取八角茴香油工艺的较佳条件为A2B2C3，八角茴香油对细菌、真菌均有一定的抗菌作用和抗氧化性。

八角茴香油；提取；抗菌；抗氧化

八角（Illicium verum Hook.f.）为木兰科八角属植物，又称八角茴香（《本草纲目》）、大茴香等，主产于我国；干燥的成熟果实入药，为常用中药，有祛风理气、和胃调中、温阳散寒、理气止痛等功效[1-2]。而且其味之浓郁，常用于食品和药物制剂的矫味和防腐。八角果实含挥发油、有机酸类、黄酮类、茴香醚、茴香醛等有效成分，具有抑菌作用[3]。近年来，科学家对天然植物的抗菌防腐作用进行了深入研究并发现了不少新颖“植物抗菌素”，并从植物体内的次生物质中寻找能抑制有害生物的有效成分，用人工直接提取应用或明确有效成分结构后，人工合成制作新型抗生素成为新药开发热点之一。同时开发高效、无毒、安全的天然抗氧化剂，具有广阔的前景[4]。笔者对八角的有效成分——八角茴香油的提取、抗菌及抗氧化性方面进行了初步的研究，结果如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

分析天平（上海TG328A，上海精密科学仪器）；753型紫外可见分光光度计（上海第三仪器厂）；岛津UV-240Z紫外分析仪；SXT-2索氏提取器 （上海洪纪仪器设备有限公司）；微量移液器（ThermoFish，芬兰雷勃）；八角（广州市药材公司）；95%乙醇（药用）；DPPH 自由基（Sigma，批号：S90790-379）。

1.2 供试菌种

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉菌、酵母菌均由广州工业微生物检测中心提供。

2 方法与结果

2.1 正交试验优选提取工艺

2.1.1 供试验用八角原料的制备 将八角置于60℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得，备用。

2.1.2 乙醇回流提取试验条件的筛选 采用正交试验设计，将影响提取效率的主要因素：八角与95%乙醇的用量比例、索氏提取的虹吸次数、室温下八角在95%乙醇中浸泡时间作为试验因子，进行3因素3水平的正交试验设计，每个试验方案重复3次，每次投放供试用八角原料20 g，收集所得八角茴香油，计算八角茴香油的提取率，取3次试验值的平均值作为各试验方案的评价指标。因素水平见表1。

2.1.3 八角茴香油提取 称取置于60℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛的八角原料20 g放入烧瓶，加入适量95%乙醇分别浸泡1.2、1.8、2.4 h，过滤，直接用过滤滤纸将过滤后的八角粉包成圆柱形，放入索氏提取器内，用少量95%乙醇洗涤烧瓶2～3次，洗涤液和滤液一起全部集合在烧瓶，加入95%乙醇至预定量，加热回流提取，回流至预定条件，停止加热，自然冷却，用倾泻法将烧瓶中的提取液转移到烧杯中，用少量乙醇洗涤烧瓶2～3次，合并提取液回收乙醇并浓缩。

2.1.4 鉴别 取“2.1.3项”下提取的八角茴香油1 ml，加无水乙醇2 ml，溶解得供试品溶液。①精密吸取该供试溶液2 μl点于以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，挥干，再点加间苯三酚盐酸试液约2 μl，即显粉红色至紫红色的圆环。②另精密吸取该供试溶液10 μl置10 ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，照分光光度法（《中国药典》2010年版附录ⅤA）测定，在259 nm波长处有最大吸收。

2.1.5 八角茴香油提取率 八角茴香油提取率（%）=八角茴香油重量/八角粉重量×100%。

2.1.6 试验与结果 根据表1选用L9（34）正交试验表研究提取工艺参数，试验设计与结果见表2，方差分析见表3。

2.2 抑菌实验

2.2.1 抑菌试液的制备 以95%乙醇倍比稀释，取“2.1.3项”下提取的八角茴香油配制成含生药100%（即1 ml含1 g）的抑菌试液50 ml；另取倍比稀释用的95%乙醇50 ml作抑菌对照试剂，备用。

表1 乙醇回流提取正交试验因素水平

表2 乙醇回流提取八角茴香油正交试验方案与结果（n=3）

2.2.2 菌悬液的制 配制牛肉膏蛋白胨培养基，转接金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉菌和酵母菌至试管斜面，25℃培养24 h活化，用灭菌注射用水洗下菌苔制成菌苔菌悬液，制成菌悬液，细菌使用平板计数法，霉菌、酵母菌使用显微镜直接记数法测菌体个数，调至浓度为含菌体为1.5×108cfu/L的菌悬液，备用。

表3 乙醇回流提取正交试验方差分析

2.2.3 抑菌滤纸片的制备 选择吸水性强的滤纸，烘干，用打孔器制成若干直径为6 mm的圆形纸片，高压灭菌。在经高压灭菌干燥后的培养皿中倒入抑菌试液30 ml，用镊子将滤纸片夹入浸泡12 h后后置于经干燥灭菌的培养皿中，备用。

2.2.4 抑菌圈的测定[5]取制备好的抑菌滤纸片贴在含菌平板上，每皿贴3片。细菌置培养箱37℃培养24 h，酵母菌置培养箱28℃培养48 h，霉菌置培养箱28℃培养1周。选取抑菌圈比较明显的平板测定抑菌圈直径，取3贴测定的抑菌圈直径的平均值。95%乙醇作抑菌对照，同时设立灭菌注射用水阴性对照。结果：大肠埃希菌的抑菌圈直径是14.21 mm，金黄色葡萄球菌是15.32 mm，酵母菌的抑菌圈直径是15.01 mm，黑曲霉菌的抑菌圈直径是11.10 mm。

2.2.5最低抑菌浓度（MIC）试验 采用两倍稀释法；分别取经高压灭菌试管8支，将抑菌试液1 ml以灭菌注射用水倍比稀释成 0.5、0.25、 0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 g/ml。第7号管作为不加抑菌试液的对照管，第8号管只加抑菌试液1 ml作为不加菌悬液的对照管。在每个试管中加入9 ml琼脂培养基，充分混匀，待完全凝固后用加样器接种1 ml菌悬液，细菌置培养箱中37℃培养24 h，酵母置培养箱中28℃培养48 h，霉菌置培养箱中28℃培养1周。以肉眼观察，以药物最低浓度管无细菌生长者为受试菌的MIC值（mg/L），所有试验均在不同日期重复3遍。结果：大肠埃希菌MIC是31.25，金黄色葡萄球菌MIC是15.625，酵母菌MIC是62.5，黑曲霉菌MIC是62.5。

2.2.6 抑菌圈的判定标准[6]抑菌圈直径＞15 mm为最敏感，10～15 mm为中度敏感，7～9 mm时为低度敏感，无抑菌者为不敏感。

2.2.7 结果 八角茴香油浓度在15.62～62.50 mg/ml时对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉菌等呈中度敏感，具有抗菌活性。

2.3 清除DPPH-自由基能力的测定[7]

精密称取DPPH·10 mg溶于100 ml无水乙醇，得储备液，冰箱避光保存。用时稀释4倍得6.5×10-5mol/L DPPH·溶液，按“表4”加样，反应30 min后1 cm比色皿517 nm下测定吸光值。重复测定3次，结果取平均值。另将八角茴香油（待测抗氧化剂）用蒸馏水和70%乙醇分别配制成浓度0.03%、0.06%、0.09%、0.12%的系列溶液，分别按“表 4”加样，反应30 min后分别依次在517 nm下测定吸光值（n=3），取3次测定值的平均值分别计算清除率（%），所对应的清除率分别为 23.15%、44.23%、60.12%、70.14%。

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100%。

表4 DPPH实验加样量

3 讨论

3.1 对表2进行数据处理

由直观分析和方差分析可知，以八角茴香油取油量为评价指标 ，最佳提取工艺条件为 A2B2C3，各因素的主次顺序为C＞B＞A，但方差分析表明各因素对八角茴香油提取的量均无显著影响（表3）。基于以上分析，可确定本方案提取八角茴香油工艺的最佳条件为A2B2C3，即加乙醇倍量为6倍，虹吸次数为6次，浸泡时间为2.4 h。采用乙醇回流提取八角茴香油，提取出的有效成分较多，溶剂对环境和人体都安全而且用量较少，提取时间短；但优选乙醇浓度对八角茴香油提取效率的影响还需要进一步的探索；同时提取物在制备、储存时存在提取物易挥发损失。剂量不易控制、稳定性差等缺点，要实际应用于规模化生产还需要有相关的技术来解决。

3.2 八角茴香油对供试菌的抑菌分析

实验显示，八角茴香油对金黄色葡萄球菌、酵母菌的抑菌直径＞15 mm，属最敏感，对大肠埃希菌、霉菌的抑制属中度敏感，这表明八角对细菌和真菌均有很强的抑制作用。提取物对液菌种的MIC值表明八角对酵母菌、霉菌的抑菌浓度＞6.3%，大肠埃希菌＞3.1%，对金黄色葡萄球菌＞1.6%与提取物抑菌试验结果相吻合。对细菌的抑制作用较强，对真菌也有一定的抑制作用，但相对较弱，可见八角对各种菌都有比较强的抑制作用，它是一种天然的广谱抗菌药。当然对在试验中采用八角茴香的醇提取液进行室内生化检测试验，对某些含量较少但又有抑菌活性的物质有可能难以表现出活性，应该采用活性追踪的方法对粗提液进行进一步的分离、纯化以寻找或确定其主要或有效抑菌活性成分。对抗菌剂而言，离体条件下无效的提取液有可能会在活体上表现活性，因此，有必要对八角茴香的乙醇提取物进行活体抑菌试验，以便于进一步研究。八角茴香的乙醇提取物的抗菌谱、作用方式、作用机制有待于进一步研究。

3.3 八角茴香油的抗氧化作用

试验结果表明，八角茴香的乙醇提取物对DPPH-自由基有明显的清除作用，在试验区间，随着浓度的增加，其对DPPH-自由基的清除能力也增强。关于DPPH·法检测抗氧化活性相对于抗氧化能力的体内测定方法而言，这种体外测定方法时间短，所需的经费较少，所需用的仪器设备较简单，在国内外有着广泛的应用；但是在试验过程中存在一些条件选择的差异，如初始浓度、反应时间等[8-9]。

志谢：承蒙主任中医师傅旭东对八角进行鉴定，谨此致谢。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第三十卷第一分册)[M].北京:科学出版社,1996:228.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2010:4.

[3]赵俊丽,骆志成,武三卯,等.八角茴香挥发油抗念珠菌活性的体外研究[J].中华皮肤科杂志,2004,37(8):475-477.

[4]乔凤云,陈欣,余柳青.抗氧化因子与天然抗氧化剂研究综述[J].科技通报,2006,22(3):332-336.

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Extraction process of star anise oil and its antibacterial and antioxidative effects

FU Mingdong,LI Chenghuan
Yuebei People's Hospital Affiliated to Shantou University Medical College,Guangdong Province,Shaoguan 512026,China

Objective:To study the extraction process of star anise oil and its antibacterial and antioxidative effects.Methods:The extraction process,antibacterial effects and radicals scavenging ability of star anise oil in star anise were studied by the orthogonal test,in vitro antibacterial test and para-DPPH-radical scavenging ability test using 95%ethanol as the solvent.Results:The results showed that the best star anise oil extraction process was star anise to 95%ethanol solution ratio of 1∶6,siphon times of 6 times and soaking time of 2.4 hours.Star anise oil at the concentration of 15.62 to 62.50 mg/ml was moderately sensitive to escherichia coli,staphylococcus aureus,yeasts,aspergillus niger and others,and its para-DPPH-radical scavenging ability increased with the increasing concentration.Conclusion:The best conditions of star anise oil extraction process using the ethanol reflux are A2B2C3.Star anise oil has certain antibacterial and antioxidative effects on bacteria and fungi.

Star anise oil;Extraction;Antibacterial;Antioxidative

R282.71

A

1673-7210（2011）12（a）-029-03

2011-05-24）