食管癌放疗前后外周血癌胚抗原mRNA与蛋白检测的对比研究

薛金俊，袁 昕，殷旭东，汪 瑞，张正荣，夏广鑫

江苏省扬州市第一人民医院肿瘤科，江苏扬州 225009

食管癌是我国高发恶性肿瘤之一，因早期症状不明显，大部分患者确诊时已属中晚期，如何提高食管癌早期诊断率和改善中晚期患者疗效是亟待解决的重要课题。研究表明，肿瘤细胞在其早期阶段就可能进入血液循环，而患者常无任何临床表现，常规检测手段亦不能发现，即肿瘤微转移（micrometastasis）[1]。 目前，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）已成为肿瘤早期诊断、预后判断及疗效评估的重要手段[2]。 癌胚抗原（carcinogenic embryonic antigen，CEA）是一分子量为20万左右的糖蛋白，特异性地表达于上皮组织及其起源的肿瘤组织，而外周血中无上皮细胞，故可视为CTC标记[3]。本研究应用巢式RT-PCR技术检测72例根治性放疗食管癌患者外周血中CEA mRNA的表达，并与临床常用的血清CEA蛋白检测进行比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年3月～2009年3月在我院行根治性放疗食管鳞状细胞癌（ESCC）患者72例，其中，男54例，女18例；年龄46～83岁，中位年龄63岁；原发肿瘤部位：胸上段15例，胸中段46例，胸下段11例。根据放疗前影像学检查结果，依照我国《非手术治疗食管癌的临床分期标准（草案）》[4]分期：其中，Ⅰ期8例，Ⅱ期37例，Ⅲ期27例。入组条件符合以下标准：经胃镜病理检查确诊；均为初治患者；无放疗禁忌证；无远处转移；KPS评分≥70分；预计生存期≥3个月；实验室检查主要指标无异常。所有患者采用6 MV-X射线，2.0 Gy/次，5次/周，总剂量60～70 Gy，分30～35次完成放疗计划。放疗结束后采用RECIST实体瘤疗效标准进行评价[5]，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）、进展（PD），有效率=[（CR+PR）/总例数]×100%。

1.2 试剂与仪器

淋巴细胞分离液购自上海华精生物科技公司；Trizol细胞裂解液购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒和DNA Marker购自Takara公司；基因引物由上海英骏生物技术公司合成；梯度PCR仪和分光光度计为Eppendorf公司产品；凝胶电泳成像系统为上海培清科技有限公司产品。CEA蛋白水平来自我院核医学科检查报告（≥3.5 μg/L为阳性结果），测定仪器为Roche Diagnostics全自动免疫分析仪。

1.3 标本处理及RNA提取

放疗前及放疗结束两周内留取外周血10 ml（EDTA抗凝），采用淋巴细胞分离液分离单核细胞，生理盐水洗涤后置于-80℃冰箱备用。同期收集20例食管良性疾病患者外周血及10例食管癌术后组织标本作为对照。采用Trizol一步法提取细胞和组织的总RNA，无RNA酶的DNase去除混杂的DNA，紫外分光光度计定量。

1.4 巢式RT-PCR

取1～2 μg总RNA，70℃ 5 min预变性后，依试剂盒说明进行cDNA合成。继而取4 μl cDNA行第1轮PCR扩增，取第1轮PCR产物0.5 μl行第2轮PCR扩增。PCR反应体系包括 10×PCR buffer 2.5 μl（含 Mg2+，终浓度在 1.5 mmol/L），dNTP mixture 2.5 μl（终浓度 250 μM/L），上下游引物各 2 μl（20 pmol），Taq 酶 0.15 μl，灭菌去离子水补足至 25 μl。 引物序列及反应条件参见文献[6]。取第2轮PCR扩增产物5 μl行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，率的比较采取χ2检验或Fisher确切概率法，诊断效能通过受试者特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗前CEA mRNA、蛋白表达

CEA mRNA检测典型PCR结果如图1所示。72例食管癌患者中，放疗前CEA mRNA阳性者为34例（47.2%，敏感性），血清CEA蛋白升高者为16例（22.2%，敏感性）；而20例食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性者为0例（100%，特异性），CEA蛋白升高者为2例（90%，特异性）。10例食管癌术后组织标本CEA mRNA表达均为阳性。CEA mRNA与CEA蛋白诊断食管癌的Youden指数（Youden指数是将灵敏度与特异度综合起来评价某种检查方法的真实性的指标，指数范围为0～1，Youden指数越大，真实性越大）分别为0.472与 0.122，ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.736与0.561（图 2），可见 CEA mRNA的诊断效能显著优于血清CEA蛋白。

2.2 CEA mRNA、蛋白表达的临床病理联系

放疗前CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关（P=0.046），与年龄、性别、肿瘤位置、病变长度、分期等因素无关；而血清CEA蛋白水平升高与食管癌临床病理特征均无关。见表1。

2.3 CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效的关系

图2 食管癌外周血癌胚抗原mRNA与蛋白检测的诊断效能

表1 食管癌外周血癌胚抗原mRNA、蛋白表达与临床病理特征的关系

放疗结束后评价，CR 8例，PR 39例，SD 20例，PD 5例，放疗前CEA mRNA、蛋白水平与放疗有效率无关，而放疗后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关，CEA mRNA由阳性转阴或血清CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好。见表2。

3 讨论

放射治疗是食管癌治疗的主要手段之一，由于食管的组织结构和自身生物学等方面的特点，相当一部分食管癌患者不宜手术或不愿手术而接受放射治疗。但多年来食管癌的放射治疗效果尚不理想，5年生存率不足10%，失败原因主要是局部未控或复发[7]，而肿瘤微转移可能在其中起到关键作用。因此，若能及时监测循环肿瘤细胞（CTC），将对食管癌早期诊断及指导临床治疗具有重要价值[2]。由于受到人体免疫系统的清除，存活的CTC数量极少，对检测方法要求较高。RT-PCR技术具有高度灵敏性，可鉴别106～107个正常细胞中的一个肿瘤细胞，是目前最常用的方法[8]。

表2 食管癌外周血癌胚抗原mRNA、蛋白表达与放疗疗效的关系[n（%）]

血清CEA是食管癌常用的肿瘤标记物之一，但一直存在敏感性低、特异性差的问题。近年来，以CEA mRNA为标记的CTC检测则展示出较好的前景，在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌和宫颈癌等多种恶性肿瘤中得到广泛应用[3]。如Qiu等[9]报道，103例胃癌外周血CEA mRNA阳性占36.6%，CEA mRNA表达与肿瘤浸润深度和术后复发有关，并且，CEA mRNA比血清CEA蛋白在预测复发方面具有更好的敏感性。Ishigami等[10]则发现，胃癌外周血CEA mRNA拷贝数而非阳性率与术后复发有关。在食管癌中，Nakashima等[11]报道，外周血CEA mRNA阳性占57.4%（31/54），且CEA mRNA阳性与淋巴结转移、肿瘤分期和术后复发有关，而血清CEA水平与之无关。Liu等[12]应用realtime PCR 检测食管癌术前 1 d（B-1）、手术当天（B0）和术后3 d（B+3）外周血中以CEA mRNA为标记的CTC数目，发现B-1与B0，B-1与B+3间均有统计学差异，且B+3/B0>0.4预示较高的转移风险；Tanaka等[13]也发现以CEA mRNA和鳞状细胞相关抗原 （SCC）mRNA为标记的鳞状细胞癌相关抗原（CTC）是食管癌术后无进展生存的独立预后指标。上述结果都证实外周血CEA mRNA检测在食管癌中的应用价值。

本研究结果表明，食管癌根治性放疗前外周血CEA mRNA阳性与 CEA蛋白升高者分别占 47.2%（34/72）与22.2%（16/72），而食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性与CEA蛋白升高者分别为0与10.0%（2/20），CEA mRNA的诊断效能显著优于CEA蛋白。且CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关 （P=0.046），CEA蛋白升高与食管癌临床病理特征无关，提示以CEA mRNA为标记的CTC在食管癌预后中的潜在价值。同时，笔者发现放疗前后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关，CEA mRNA由阳性转阴或CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好，推测是由于放疗有效地减少肿瘤负荷，从而停止释放癌细胞及癌相关抗原入血。

总之，外周血CEA mRNA阳性对于食管癌早期诊断及放疗疗效评估具有重要意义，如检测方法进一步得以改进，使之更加方便并满足定量需求，则可望成为替代血清CEA蛋白的有效分子标记。

[1]Riethdorf S,Wikman H,Pantel K.Review:Biological relevance of disseminated tumor cells in cancer patients[J].Int J Cancer,2008,123(9):1991-2006.

[2]Armakolas A,Panteleakou Z,Nezos A,et al.Detection of the circulating tumor cells in cancer patients[J].Future Oncol,2010,6(12):1849-1856.

[3]郑弘宇,陈强,叶韵斌,等.乳腺癌患者外周血癌胚抗原及细胞角蛋白19 mRNA表达的临床意义[J].中华医学杂志,2008,88(32):2267-2270.

[4]中国非手术治疗食管癌临床分期专家小组.非手术治疗食管癌的临床分期标准(草案)[J].中华放射肿瘤学杂志,2010,19(3):179-180.

[5]Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,et al.New response evaluation criteria in solid tumors:revised RECIST guideline(version 1.1)[J].Eur J Cancer,2009,45(2):228-247.

[6]Huang P,Wang J,Guo Y,et al.Molecular detection of disseminated tumor cells in the peripheral blood in patients with gastrointestinal cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(3):192-198.

[7]任群,余建和,吴祥.FP方案同步放射治疗食管癌的临床分析[J].实用临床医药杂志,2010,14(13):119-120.

[8]Ring AE,Zabaglo L,Ormerod MG,et al.Detection of circulating epithelial cells in the blood of patients with breast cancer:Comparison of three techniques[J].Br J Cancer,2005,92(5):906-912.

[9]Qiu MZ,Li ZH,Zhou ZW,et al.Detection of carcinoembryonic antigen messengerRNA in blood using quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction to predict recurrence of gastric adenocarcinoma[J].J Transl Med,2010,8:107.

[10]Ishigami S,Sakamoto A,Uenosono Y,et al.Carcinoembryonic antigen messenger RNA expression in blood can predict relapse in gastric cancer[J].J Surg Res,2008,148(2):205-209.

[11]Nakashima S,Natsugoe S,Matsumoto M,et al.Clinical significance of circulating tumor cells in blood by molecular detection and tumor markers in esophageal cancer[J].Surgery,2003,133(2):162-169.

[12]Liu Z,Jiang M,Zhao J,et al.Circulating tumor cells in perioperative esophageal cancer patients:quantitative assay system and potential clinical utility[J].Clin Cancer Res,2007,13(10):2992-2997.

[13]Tanaka K,Yano M,Motoori M,et al.CEA-antigen and SCC-antigen mRNA expression in peripheral blood predict hematogenous recurrence after resection in patients with esophageal cancer[J].Ann Surg Oncol,2010,17(10):2779-2786.