对甲基苯甲酸连接的氯霉素全抗原合成与鉴定

罗舜菁，陈婷婷，刘成梅，*，邹常春，严杰琳，陈 臣，高 鹏

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047; 2.南昌大学，江西南昌330031)

对甲基苯甲酸连接的氯霉素全抗原合成与鉴定

罗舜菁1，陈婷婷1，刘成梅1，*，邹常春2，严杰琳1，陈 臣1，高 鹏1

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047; 2.南昌大学，江西南昌330031)

以对氯甲基苯甲酸(CBA)或对氯甲基苯甲酸甲酯(MCB)分别与氯霉素(CAP)反应合成氯霉素-对甲基苯甲酸半抗原(CAP-MBAⅠ、CAP-MBAⅡ)，再与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备全抗原;通过紫外、荧光光谱扫描定性鉴定合成成功;bradford法结合TNBS法定量计算出全抗原表面半抗原密度(HD)。再将CAP-MBAⅡ与卵清蛋白(OVA)合成包被抗原(CAP-MBAⅡ-OVA)，间接竞争ELISA计算其抑制率。研究结果表明，半抗原全抗原偶联效率优于CAPMBAⅠ，MCB与CAP反应合成的半抗原CAP-MBAⅡ更适合蛋白偶联。采用CAP-MBAⅡ-OVA作为包被抗原可以提高ELISA检测的抑制率从而增加其灵敏度。

氯霉素，对甲基苯甲酸，连接臂，全抗原

图1 氯霉素及其体内主要代谢产物氯霉素糖醛酸的分子结构

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯霉素 BBI公司;对氯甲基苯甲酸、对氯甲基苯甲酸甲酯 强中化工;琥珀氯霉素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、三硝基苯磺酸 sigma公司;bradford蛋白浓度测定试剂盒 碧云天生物技术研究所;其余试剂 均为分析纯。

DU 640可见-紫外分光光度计 美国Beckman Coulter公司;F-4500型荧光光度计 日本日立公司;Multiskan MK3酶标仪 美国 Thermo Fisher公司。

1.2 实验方法

1.2.1 半抗原氯霉素-对甲基苯甲酸(CAP-MBA)的合成

1.2.1.1 对氯甲基苯甲酸与氯霉素的反应 称取66mg CAP溶于4mL DMF与1，4-二氧六环的混合溶液中(1∶1，V/V)，加入34mg对氯甲基苯甲酸，40℃搅拌反应8h，采用硅胶薄层层析(TLC)监测合成反应进行。产物记作CAP-MBAⅠ，真空干燥备用。

1.2.1.2 对氯甲基苯甲酸甲酯与氯霉素的反应 称取66mg CAP溶于4mL DMF与1，4-二氧六环体积比为1∶1的混合溶液中，加入44mg对氯甲基苯甲酸甲酯，80℃加热搅拌4h后，加入6mol/L的NaOH溶液0.2mL去甲酯化，室温反应3h后，离心后取上清液，加入6mol/L的 HCl溶液调节 pH至7，反应10min，采用TLC监测反应进行。产物记作 CAPMBAⅡ，真空干燥备用。

1.2.2 全抗原合成

1.2.2.1 免疫抗原的合成 称取120mg的 BSA溶于12mL DMF、0.01mol/L PBS、超纯水(1∶1∶2，V/V)混合溶液中，得到10mg/mL BSA溶液，置于0℃平衡，此为A液;取1mL 0.5mol/L CAP-HS、CAP-MBAⅠ，CAP-MBAⅡ，分别加入10μL三正丁胺，冰浴条件下搅拌反应10min，加入7μL氯甲酸异丁酯，室温下搅拌反应1h，作为活化半抗原，记为B液;按CAP与BSA起始摩尔比为40∶1、30∶1、20∶1、10∶1取适量A液放入不同锥形瓶中，将1mL B液逐滴加入到对应的A液中，反应在冰浴中进行，维持pH 8.5，搅拌反应4h，反应液装入透析袋中，4℃用pH7.4 PBS透析3d，每天换液3次。透析后部分用于检测及免疫，其余真空冷冻干燥备用。

1.2.2.2 包被抗原的合成 根据本实验室前期研究结果［13］，按半抗原与OVA起始摩尔比7∶1合成包被抗原CAP-HS-OVA、CAP-MBAⅡ-OVA。具体如下:将一定量CAP-HS和CAP-MBAⅡ溶于0.01mol/L PBS溶液中，分别加入一定量的EDC-HCl和NHS，控制pH在5.0左右，室温避光振荡活化15min。加入的一定量β-巯基乙醇淬灭未反应的EDC-HCl。分别加入2mL 10mg/mL OVA溶液，室温反应2h后，反应液中加入10mmol/L盐酸羟胺，淬灭未反应的NHS。反应液用pH7.4的0.01mol/L PBS透析3d，透析后部分用于检测，其余冷冻干燥备用。

1.2.3 全抗原的抗原的鉴定

1.2.3.1 紫外光谱扫描 将半抗原CAP-HS、CAPMBAⅠ、CAP-MBAⅡ，载体蛋白 BSA及全抗原CAP-HS-BSA、CAP-MBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA稀释至合适浓度，在200～400nm处扫描紫外吸收光谱。

1.2.3.2 荧光光谱扫描 设置激发与发射狭缝宽度为5nm，扫描速度为2400nm/min，设置激发波长为280nm，在300～450nm之间扫描BSA及全抗原的发射光谱。

1.2.3.3 全抗原蛋白质浓度及其表面半抗原密度计算 Bradford蛋白浓度测定试剂盒绘制BSA浓度标准曲线，并测定CAP-HS-BSA，CAP-MBAⅠ-BSA，CAP-MBAⅡ-BSA的蛋白质浓度，记作C(bradford);采用TNBS法绘制相应的BSA浓度标准曲线，同时测定三种全抗原的浓度，记作C(TNBS)。根据bradford法及TNBS法测定蛋白质浓度算得全抗原氨基替换率，按每个BSA分子上含有60个自由氨基计算出每个BSA分子上的半抗原密度(hapten density，HD)［14］。

按每个OVA分子上含40个自由氨基计，同法算得包被抗原的半抗原密度。

表1 全抗原的蛋白浓度及表面半抗原密度

1.2.4 不同包被抗原对抗体亲和力的影响 CAPHS-OVA，CAP-MBAⅡ-OVA合成后，用间接ELISA检测2种包被抗原与抗体的亲和力。本实验所用抗体为CAP-HS-BSA免疫小鼠制得的抗氯霉素单克隆抗体。具体如下:CAP-HS-OVA，CAP-MBAⅡ-OVA稀释至5μg/mL包被酶标板，每孔100μL，4℃静置过夜后用1%PBST洗涤;加入380μL 3%脱脂牛奶封闭酶标板，37℃温育1h后洗涤;加入100μL梯度稀释的抗体，抗体稀释度为1∶800至1∶51200倍比稀释，37℃温育1h后洗涤;加入100μL酶标羊抗小鼠IgG，37℃温育1h后洗涤;加入100μL TMB显色液，37℃温育15min;加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液终止显色，用酶标仪检测其在450nm处吸光值为阳性值。抗体滴度OD值为1.0时的抗体稀释度。

1.2.5 不同包被抗原对ELISA检测灵敏度的影响采用间接竞争ELISA检测不同包被抗原对ELISA灵敏度的影响。将1.2.4加梯度稀释抗体一步改为加入50μL浓度为0、4、10、20、40、100、140、200ng/mL氯霉素标准品及50μL最佳工作浓度的氯霉素单抗，其余步骤同上。计算抑制率(Inhibition Rate)，IR= (1-B/B0)×100%，B为加入竞争品孔的吸光值，B0为竞争品浓度为0的孔的吸光值。半数抑制率IC50为抑制率达到50%时的竞争品浓度。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱

通过紫外扫描可知，CAP-MBA、CAP-HS、BSA的最大吸收峰分别在275、276、278nm处(如图2所示)。与BSA相比，全抗原CAP-HS-BSA、CAPMBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA的最大吸收峰发生轻微蓝移至277nm，峰形也略有不同。如图2b、2c所示，随着半抗原投料量的增加，全抗原的最大吸收峰值逐渐增大。可初步判断半抗原与载体蛋白偶联成功。

2.2 荧光光谱

如图3所示，随着半抗原投料量的增加，CAPHS-BSA、CAP-MBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA的荧光强度逐渐下降，最大发射波长逐渐蓝移。此现象与紫外检测结果可共同判断全抗原偶联成功。singh等对莠去津全抗原的荧光发射光谱研究也得到相似的结果［15］。这是由于在激发波长为280nm处，蛋白质内源荧光主要由酪氨酸残基和色氨酸残基产生。随着投料量的增加，蛋白质表面半抗原密度的增加，使得酪氨酸残基和色氨酸残基周围环境疏水性增加，荧光强度逐渐减弱，最大吸收波长蓝移。

2.3 免疫抗原蛋白质浓度及其表面半抗原密度计算

图2 BSA、不同半抗原及不同起始摩尔比的各种全抗原的紫外吸收光谱

图3 270nm处BSA及不同起始摩尔比的全抗原的荧光激发光谱

半抗原密度是全抗原免疫原性的重要影响因素，也对包被抗原的灵敏度有着重要影响。Bradford法是染料与蛋白上的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合，使染料的最大吸收峰465nm移至595nm进行测定，对于同种蛋白测量准确，灵敏度高。TNBS法则是测量蛋白质上的自由氨基。先由Bradford法测得蛋白质浓度，与TNBS测得浓度对比即可算出全抗原上的氨基替换率，从而计算半抗原密度。

以bradford法测定BSA浓度标准曲线，得线性回归方程，y=2.7709x+1.0779，R2=0.9961，以TNBS法测定 BSA浓度标准曲线，y=0.0081x+0.0023，R2=0.9987。

以bradford法测定OVA浓度标准曲线，得线性回归方程方程，y=2.6980x+0.9539，R2=0.9899，以TNBS法测定 OVA浓度标准曲线，y=0.0043x+ 0.0159，R2=0.9964。包被抗原CAP-HS-OVA，CAP -MBAⅡ-OVA的蛋白浓度分别为6.28、6.34mg/mL，表面半抗原密度分别为3.3、3.1。

2.4 不同包被抗原对ELISA检测的影响

在450nm处测得间接ELISA的吸光值反映了不同包被抗原对抗体的亲和力，包被抗原的表面半抗原密度及包被浓度相同，其余ELISA条件一致的情况下，吸光值越高表示抗体对包被抗原的结合力越好，亲和力越高。图4为间接ELISA中不同包被抗原对应的抗体稀释曲线。相同抗体稀释度下，CAPHS-OVA的吸光值高于CAP-MBAⅡ-OVA，由图计算二者的抗体滴度分别为19314.3和8139.6。CAPMBAⅡ-OVA的半抗原与免疫半抗原具有不同的连接臂，降低了抗体对连接臂部分的识别，因此其对抗体的亲和力小于CAP-HS-OVA［16］。

图4 两种包被抗原的抗体稀释曲线

降低ELISA检测的灵敏度是ELISA方法建立的主要目的。图5所示为间接竞争ELISA的抑制曲线，达到相同抑制率是，CAP-MBAⅡ-OVA做包被抗原的竞争品浓度低于CAP-HS-OVA。半数抑制率IC50为判断ELISA灵敏度的重要参数，包被CAPMBAⅡ-OVA和CAP-HS-OVA的ELISA检测的IC50分别为 18.25ng/mL和 23.97ng/mL。由于 CAPMBAⅡ-OVA与抗体结合力下降，使得氯霉素与抗体作用机会增加，提高对ELISA检测的抑制率，因此采用CAP-MBAⅡ-OVA做包被抗原提高了ELISA检测的灵敏度［17］。

图5 两种包被抗原的竞争ELISA抑制曲线

3 结论

半抗原设计通常包括了大量复杂的化学合成，本实验通过简单的化学合成使CAP分子接上连接臂，制得新的半抗原CAP-MBA，半抗原合成反应后，未反应的对氯甲基苯甲酸遇水析出，可以很方便地除去;而未反应的氯霉素分子不具有羧基，不参与与载体蛋白的偶联反应，可在全抗原合成反应后通过透析除去。因此本实验在半抗原合成后，不需要采用红外、质谱等精确手段鉴定半抗原CAP-MBA，可直接将其用于全抗原合成。全抗原的表面半抗原密度与反应溶液中合成成功的半抗原的含量成正比，因此通过计算全抗原的HD可半定量比较出不同方法合成的半抗原成功率。CAP-MBAⅡ-BSA表面半抗原密度(按起始摩尔比不同分别为15.0、6.6、3.3、1.7)略低于CAP-HS-BSA(17.4、11.2、4.7、3.7)，而远远高于CAP-MBAⅠ-BSA(6.4、2.6、2.3、0.2)。因此，通过将实验合成的CAP-MBA半抗原与商品化的CAP-HS比较可以得出，以对氯甲基苯甲酸合成的CAP-MBAⅠ合成效果稍差，以对氯甲基苯甲酸甲酯合成的CAP-MBAⅡ成功率较高，可用于全抗原合成。

在ELISA检测中，通过对半抗原连接位点，连接臂长度，结构等进行合理选择与搭配，可以有效地利用可预测的交叉反应，达到同时检测某一族化合物的目的，并且可以抑制不可预测的交叉反应，提高检测的特异性［18］。本实验合成半抗原CAP-MBA与琥珀氯霉素相比，连接臂连接位点相同，结构和长度不同，是理想的验证不同连接臂对ELISA检测灵敏度的半抗原。使用CAP-HS-BSA免疫小鼠获得的抗体比较包被抗原CAP-HS-OVA与CAP-MBAⅡ-OVA对ELISA检测的影响。以CAP-MBAⅡ-OVA为包被抗原亲和力较弱(抗体滴度为8139.6低于CAP-HS-OVA的19314.3)，但能提高ELISA检测的灵敏度(IC5018.25ng/mL低于 CAP-HS-OVA的23.97ng/mL)。这是由于通过选用含不同连接臂的包被抗原，可以消除识别连接臂部分抗体的干扰，从而降低抗体与包被抗原间的非特异性结合，使得竞争品对抗体与包被抗原结合的抑制率增加，达到提高ELISA灵敏度的效果，与Kim等［8］报道一致。

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Synthesis and characterization of chloramphenicol complete antigen linked by 4-methylbenzoic acid

LUO Shun-jing1，CHEN Ting-ting1，LIU Cheng-mei1，*，ZOU Chang-chun2，YAN Jie-lin1，CHEN Chen1，GAO Peng1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China; 2.Nanchang University，Nanchang 330031，China)

A new Chloramphenicol(CAP)hapten was prepared by conjugate CAP with 4-(Chloromethyl)benzoic acid(CBA)or Methyl 4-(chloromethyl)benzoate(MCB).Two types of hapten(CAP-MBAⅠ，CAP-MBAⅡ)were used to synthesis complete antigen(CA)with BSA.CA was identified by UV and florescence spectrum.The hapten density of CA was evaluated by Bradford method together with TNBS method.CAP-MBAⅡwas then linked to OVA forming Solid-coating antigen(CAP-MBAⅡ-OVA).The results showed that MCB conjugated with CAP was better than CBA.CAP-MBAⅡ-OVA can rise the inhibit rate of ELISA and sensitivity can be improved.

chloramphenicol;4-methylbenzoic acid;linking arm;complete antigen

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0200-05

氯霉素(chorampheulcol，CAP)及其体内代谢物氯霉素糖醛酸残留具有血液系统毒性，可导致不可逆的再生障碍性贫血，严重危害人类健康［1］。因此，美国、欧盟等诸多国家规定禁止氯霉素用于食源性动物，并将氯霉素列为必检项目，规定不得检出［2-3］。近年来，荧光偏振免疫分析［4］、基于表面等离子共振的生物传感器［5］等新兴免疫技术越来越多地运用到动物性食品的氯霉素检测领域，酶联免疫分析(ELISA)［6］、免疫层析［7］等传统免疫检测手段也在不断改进。氯霉素全抗原的研究作为免疫分析的核心对于提高氯霉素检测的灵敏度及准确性，提高食品中氯霉素的现场检测速度及准确度有重要的意义。异源性ELISA检测中免疫半抗原与包被半抗原的差异性越大，抗体对包被抗原的识别减弱，使得待测物能与抗体结合作用机会增加，与包被抗原充分竞争，从而能检测较低浓度的待测物，从而提高ELISA检测的灵敏度［8-9］。因此，本研究拟采用一种新的连接臂对ELISA检测灵敏度的影响。在氯霉素全抗原的制备中一般采用的偶联方法有混合酸酐法［10］、重氮化法、碳化二亚胺法［11］和羰基二咪唑法［12］等。本实验拟采用对氯甲基苯甲酸［4-(Chloromethyl)benzoic acid，CBA］或对氯甲基苯甲酸甲酯［Methyl 4-(chloromethyl)benzoate，MCB］与氯霉素合成氯霉素-对甲基苯甲酸(CAP-MBA)半抗原，选用BSA做载体蛋白，初步探索对氯甲基苯甲酸(CBA)作为连接臂合成氯霉素全抗原的方法及条件。再按照优化的方法合成包被抗原，比较氯霉素-对甲基苯甲酸(CAP-MBA)半抗原与氯霉素琥珀酸酐(CAP-HS)半抗原对ELISA检测灵敏度的影响。

2010-11-10 *通讯联系人

罗舜菁(1969-)，女，副教授，硕士，研究方向:食品安全。

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ09062)。