透明质酸产生菌分批发酵工艺条件的研究

邓开野，谭梅唇

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225; 2.广西大学，广西南宁530004)

透明质酸产生菌分批发酵工艺条件的研究

邓开野1，谭梅唇2

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225; 2.广西大学，广西南宁530004)

采用10L小型发酵罐，对变异菌株的分批发酵生产HA的培养条件进行了研究。分别考察了初糖浓度、pH、培养温度、氧的传递、HA合成前体UMP的添加对发酵的影响。结果表明，高的初糖浓度对菌体的生长和HA的合成产生抑制作用，发现5%的初糖浓度比较合适。比较理想的小罐分批发酵条件为:搅拌转速为200r/min、pH7.0、培养温度37℃、通气量2L/min。HA合成前体UMP的添加可以促进菌体的繁殖和大幅度地提高HA的产量。

透明质酸，分批发酵，工艺条件

菌种 实验室筛选和诱变出的产生透明质酸的变异株;种子培养基 2%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏 1%，NaNO30.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，调pH7.0，121℃灭菌20min;发酵培养基 4%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏1%，硝酸钠0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，调pH7.0，121℃灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 斜面与种子培养方法 将筛分的菌种，于斜面培养基上划线传代。将斜面试管放在恒温箱中，在37℃条件下培养14～16h。培养结束后，用接种针在斜面培养基中挑取生长状态良好的菌落2～3环，接入250mL三角烧瓶中，烧瓶内装50mL种子培养基，把接菌后密封好的250mL三角烧瓶，置于以200r/min旋转的摇床中培养16h，培养温度37℃。

1.2.2 摇瓶培养方法 培养结束后，按10%的接种量计算，从250mL三角烧瓶中吸取0.2mL已培养好的菌液，接入500mL三角烧瓶中，内装发酵体培养基20mL。再将此500mL三角瓶置于转速为200r/min的摇床中振荡培养，在37℃条件下培养24h。

1.2.3 发酵罐培养 采用10L的发酵罐(江苏达森发酵设备有限公司)，配有单只圆盘平桨，配有德国梅特勒公司的仪表(溶氧探头和pH探头，可自动控制pH)，自动控温等。加入5L发酵培养基，121℃灭菌30min。接种量为10%(v/v)，发酵过程中采用2mol/L NaOH自动控制pH，初始淀粉的葡萄糖水解液的浓度为 5%，搅拌转速 200r/min，通气量为2.4L/min，发酵温度为37℃。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 吸光度(OD值)的测定 发酵液50mL，在4000r/min条件下离心15min后，在上清液中，加入3倍体积的乙醇，析出的沉淀加入与发酵液同体积的0.1mol/L NaCl溶液，置于磁力搅拌器中，在196nm处测定发酵液的吸光度，该吸光度值的大小可以指示发酵液中透明质酸含量的高低。

1.2.4.2 菌体含量的测定 菌体量的测定:采用干重法。将发酵液离心后取沉淀，加稀酸溶解碳酸钙，再离心取沉淀，80℃干燥24h后，称取重量，计算细胞浓度。

1.2.4.3 乳酸含量测定 对羟基联苯法［2］。

1.2.4.4 葡萄糖含量测定 采用3，5二硝基水杨酸法［3］。

2 结果与讨论

2.1 初糖浓度对HA发酵的影响

2.1.1 初糖浓度对变异菌株菌体生长的影响 图1为不同初始淀粉的葡萄糖水解液浓度下，菌体的生长过程曲线，图2为底物消耗曲线。从图1和图2可见，菌体可以在较大的范围内生长，初糖浓度为3%～8%时，菌体均能很好地生长，最终菌体浓度可以达到1.71～4.75g/L。但较低初糖浓度时，菌体的生长延迟期较短，可以高速度生长，菌体进入快速糖耗阶段的时间随初糖浓度的升高而延迟，当初糖浓度为8%时，在发酵初始的10h内，几乎没有底物的消耗，因此可以认为初糖浓度高对菌体生长有抑制作用。

图1 不同初糖浓度对菌体生长的影响

2.1.2 初糖浓度对HA合成的影响 由表1可以看出，在初糖浓度为8%时，吸光度值最大为2.869，表明发酵液中HA的含量最多。结合图1可见，菌体的生长和产物合成的延迟期一致。初糖浓度高，菌体量多，发酵结束时所获得的HA产量也越高。但高的初糖浓度对菌体生长有抑制作用，发酵迟滞期延长，而当初糖浓度低时，菌体量和HA产量又偏少。所以实验在分批发酵过程中，采用5%浓度淀粉葡萄糖转化液为发酵的初糖浓度。

图2 不同初糖浓度对葡萄糖消耗的影响

表1 初糖浓度对发酵结果的影响

图3为该菌株发酵过程中乳酸的变化曲线。由图3可知，在淀粉的葡萄糖水解液的初始葡萄糖浓度为3%、4%、5%、8%时，微生物可将底物的70%～80%转化为乳酸，乳酸相应产量可达23.8、41.9、61.4、75.12g/L。发酵过程中，乳酸的合成和菌体的生长趋势一致，说明菌体生长旺盛，则乳酸的产量也高。在不同的乳酸浓度下同时测定发酵液中HA的量，结果如图4所示，表明当乳酸浓度达到40g/L时，HA的合成基本停止。可以认为在此浓度之上，乳酸对HA的合成形成了强烈的抑制，而在此浓度之下，乳酸的抑制作用则大为减弱。通过以上分析，发现淀粉的葡萄糖水解液的初始糖浓度，对该菌种的生产性能有很大的影响:高的初糖浓度对菌体生长和产物的形成产生抑制，而发酵过程中产生的乳酸，随着初糖浓度的增加而增加，发酵液中乳酸的量的增加反过来又对HA的合成产生抑制。而当初糖浓度小于5%时，菌体量和HA产量又明显减少，当初糖浓度较高时，发酵时间延长，所以本研究认为利用该选育菌株发酵生产HA，采用初始葡萄糖浓度为5%的淀粉水解液较为适宜。

图3 不同初糖浓度下乳酸的变化

图4 不同的乳酸浓度对HA合成的影响

2.2 pH对发酵的影响

2.2.1 pH对变异菌株菌体生长的影响 本实验采用了不同pH的培养基进行发酵，结果见图5。pH为7.0时细胞生长最好，细胞量达到最大，同时在中性偏酸，即pH在6～7的范围内，菌体能较好地生长。摇瓶发酵研究发现，如不对pH进行控制，pH将迅速下降到5.0左右，菌体的生长和代谢极其有限。pH为8.0时，菌体生长极为缓慢，pH过高，以致于限制了微生物的生长。

图5 不同pH对菌体生长的影响

2.2.2 pH对HA合成的影响 由表2可见，pH为7.0时，发酵液的吸光度值最大，表明发酵液中HA的含量最多。当把培养基的pH调到8.0时，吸光度值最小，发酵液中HA含量最少，这与不同pH对菌体生长影响有相同的趋势。由图6可以看出，本研究筛选得到的突变菌株可以在中性或弱酸性的条件下生长，利用葡萄糖的速度基本一致，在pH6.5时，耗糖速度略快些，而pH8.0时，耗糖的速度慢。

综合分析以上实验结果，可见要使突变菌株正常进行发酵，需将pH控制在6.5～7.0范围内。

表2 不同pH对发酵结果的影响

图6 不同pH下淀粉水解液中葡萄糖的利用曲线

2.3 温度对HA发酵的影响

2.3.1 温度对菌体生长的影响 本研究考察了不同的发酵温度对菌体生长的影响情况，结果如图7所示。结果表明，随着温度的升高，细胞生长速度加快。33℃时，细胞量仅为2.2g/L，39℃时细胞含量最多，可达到3.94g/L。

图7 温度对菌体生长的影响

2.3.2 温度对HA合成的影响 由表3可见，温度为33℃时，发酵液中HA的量不多，而在39℃时，HA的量最小。可见高温虽然对菌体生长有利，但不利于HA的合成，由于在高温时，菌体将培养基中的营养成分大部分用来菌体生长，而到了产物合成阶段，已经没有养分可以利用，所以严重影响了产物的合成。而发酵温度为35℃时，发酵液的吸光度值最大，表明HA的含量最高。因此，35℃是较为合适的小罐发酵温度。

表3 温度对发酵结果的影响

2.4 氧的供给对HA发酵的影响

2.4.1 搅拌转速对HA生产的影响 表4表明，采用10L小型发酵罐进行发酵时，转速小于200r/min时，发酵液的吸光度值随着转速的增加而增加，表明发酵液中HA的含量也随着搅拌速度的增加而增加，这是因为，HA的形成使发酵液的粘度显著增高。而采用高的搅拌速度，HA含量反而下降，造成这一结果的原因可能是较大的搅拌速度对菌体细胞产生伤害，导致细胞合成HA的能力下降。分析上述结果认为，小罐的分批发酵可采用200r/min的搅拌速度。

表4 搅拌速度对HA发酵的影响

2.4.2 通气量对HA发酵的影响 由表5可知，通过增加通气量来提高发酵液中溶解氧的浓度，改善氧传递的效果呈现递减的趋势。当气流速度大时，再依靠增加通气量的手段来提高氧的传质效率的效果并不明显，还起到反作用。结果表明，通气量低，对合成HA有利，所以，分批发酵时，采用2L/min的通气量较为理想。

表5 通气量对HA发酵的影响

2.5 分批发酵培养条件的优化与控制

综合上述实验结果，各单因素实验得到的较优条件是:初糖浓度5%，pH7.0，培养温度35℃，搅拌转速200r/min，通气量2L/min，利用该较优条件进行发酵，结果如表6所示。

表6 发酵条件对发酵的影响

由表6可见，较优条件下发酵，并不能得到最好的结果，也就是说各项较优条件并不能表现为简单的加和，较优条件时所测得的发酵液吸光度值低于单因素实验中所得的结果。所以，研究改变温度，将最后实验条件确定为:初糖浓度5%，pH7.0，培养温度37℃，搅拌转速200r/min，通气量2L/min。

2.6 尿苷-磷酸(UMP)对发酵的影响

在配制好发酵培养基后，在接种时，把0.8g/L的UMP，加入到培养基中进行培养。本研究考察了两种初始葡萄糖浓度情况下对HA合成的影响。待发酵结束后，测量发酵液中的菌体含量和196nm处的吸光度，结果见表7。

表7 加入UMP对发酵的影响

由表7可见，加入UMP可以明显地提高HA的产量。在低葡萄糖初始浓度下，产量提高了7%左右，而菌体量的变化不大。在5%的初始葡萄糖浓度下，HA的产量提高了近30%，而菌体量提高的幅度也较为明显。产量完全提高的原因可能是由于链球菌的三羧酸循环不完全，外源UMP的加入为HA的合成提供了前体，并直接参与HA合成的次级代谢反应，从而促进HA的产量和菌体量的提高。

3 结论

3.1 采用10L小型发酵罐，对所筛选诱变后获得的变异菌株的分批发酵生产HA的培养条件进行了研究。分别考察了初糖浓度、pH、培养温度、氧的传递等对发酵的影响。结果表明，高的初糖浓度对菌体的生长和HA的合成产生抑制作用，发现5%的初糖浓度比较合适。

3.2 采用单因素的实验结果，对发酵条件进行了优化。获得的比较理想的小罐分批发酵条件为:搅拌转速为200r/min、pH7.0、培养温度37℃、搅拌转速200r/min、通气量2L/min。

3.3 考察了HA的合成前体加入到发酵培养基中，对发酵的影响，结果表明，HA合成前体UMP的添加可以促进菌体的繁殖和大幅度地提高HA的产量。

［1］汪蝾，张云开，韦航，等.透明质酸徽生物发酵法生产工艺条件的研究［J］.广西农业科学，2001(4):190-192.

［2］Barker S B，Summerson W H.The Colorimetric determination of lactic acid in biological material［J］.J Biol Chem，1949，138: 535-554.

［3］Miller G L.Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1960，31(3):426-428.

Study on the technology of batch fermentation for hyaluronic acid producing strain

DENG Kai-ye1，TAN Mei-chun2
(1.College of Light Industry and Food Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China;2.Guangxi University，Nanning 530004，China)

Batch fermentation condition was determined by using 10L fermenter.The effective factors to the fermentation were discussed，such as initial glucose concentration，pH value，temperature，oxygen impressing，adding synthesized precursor.The results showed that the higher initial glucose concentration could restrain the bacterial growth and HA synthesizing，and 5% initial glucose concentration was suitable.The ideal batch fermentation conditions were stirring speed 200r/min，pH7.0，cultural temperature 37℃，aeration volume 2L/min.The adding of precursor could promote the reproduce of bacterial and enhance the HA yield.

hyaluronic acid;batch fermentation;process conditions

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0221-04

在摇瓶发酵过程中，发现pH变化很大，如不能对其进行很好地控制，发酵液的pH会迅速降低(5.0左右)，使得摇瓶发酵过程中，HA在发酵液中的积累不是很多，在紫外分光光度计上，吸光度值平均只有2.256左右。由于小型发酵罐的易操作性，可以通过控制溶氧浓度、温度、pH等来控制发酵，同时分批操作也是工业化生产的基础，因此，对分批发酵过程及条件的研究有助于揭示微生物发酵的本质，了解发酵的规律。实验采用10L小型发酵罐，考察了该菌种分批发酵的生产条件，研究了发酵条件对HA产量的影响，提出了较为适宜的分批发酵培养条件，为建立HA分批发酵动力学模型和对发酵过程的优化和控制打下了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2010-03-15

邓开野(1968-)，女，博士，副教授，研究方向:发酵工程。