甘蔗叶黄酮分离纯化工艺及生理活性研究

阎欲晓，黄 玥

(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005)

甘蔗叶黄酮分离纯化工艺及生理活性研究

阎欲晓，黄 玥

(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005)

实验以甘蔗叶为原料，研究黄酮类化合物分离纯化工艺，并研究甘蔗叶黄酮对羟自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)和亚硝酸盐(NO2-)的清除能力。结果表明，利用超声波辅助提取，甘蔗叶黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度80%，提取温度60℃，超声提取时间60min，料液比1∶40，超声波功率为104W，该工艺制备得到的甘蔗叶黄酮提取量为22.13mg/g。甘蔗叶黄酮粗提物对自由基和亚硝酸盐均具有较强的清除作用。采用AB-8大孔树脂进行纯化，纯化条件为上样浓度1.9mg/mL，上样流速1mL/min，流量为3BV的70%乙醇洗脱。

甘蔗叶，黄酮，超声波，生理活性，大孔树脂，分离纯化

1 材料与方法

1.1 材料与设备

甘蔗叶 采集于广西大学农学院甘蔗种植田，烘干粉碎备用;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所;氢氧化钠、无水乙醇、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、焦性没食子酸、硫酸亚铁、邻菲啰啉、无水对氨基苯磺酸、N-1-苯基乙二胺 均为分析纯;AB-8树脂上海摩速科学器材有限公司。

数显恒温水浴锅，UV-1240紫外分光光度计，SONICS超声波破碎仪(功率130W)，旋转蒸发仪，层析柱等。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮含量的检测方法 准确称取芦丁0.0200g，用50%乙醇溶解定容至100mL，摇匀，制备成0.2000mg/mL的标准溶液，装入棕色瓶中，备用。取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加50%乙醇稀释至6mL，各加5%亚硝酸钠1mL，混匀，放置6min。加入10%硝酸铝1mL，摇匀，再放置6min，加入5%氢氧化钠10mL，最后用50%乙醇溶液定容到 25mL，静置15min，以相应试剂为空白，在510nm的波长处测吸光度A，以吸光度为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为:y=12.304x-0.0019，R2=0.9993。精确吸取提取一定量待用的样液于25mL的容量瓶中，以下操作同标准曲线的制作。根据吸光度和回归方程计算黄酮含量并依据以下公式计算样品总黄酮提取量。

样品中黄酮含量率(mg/g)=标准曲线中计算样品浓度值×25×样品总体积(mL)/原料干重(g)×取样体积(mL)

1.2.2 甘蔗叶总黄酮提取条件的优化 采用超声波辅助提取工艺，在单因素实验的基础上，着重考察乙醇浓度(A)、提取温度(B)、超声时间(C)、料液比(D)对甘蔗叶黄酮提取效率的影响。选用L9(34)正交实验设计，对甘蔗叶总黄酮提取工艺进行优化。

表1 正交实验因素水平表L9(34)

1.2.3 甘蔗叶生理活性的研究

1.2.3.1 清除羟自由基(·OH) 利用Fenton反应检测对羟基自由基的清除作用。取1mL 0.75mmol/L邻二氮菲-无水乙醇溶液于试管中，依次加入2mL 0.15mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH=7.40)和1mL蒸馏水，充分摇匀，再加入1mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4)，混匀后加入 1mL 0.01%双氧水(H2O2)，置于37℃水浴保温60min，然后在536nm测定吸光值，所得数据为损伤管的吸光值A损伤。以1mL蒸馏水代替损伤管中的1mL 0.01%双氧水(H2O2)，操作方法同损伤管，可测得未损伤管的吸光值A空白。取不同体积的样品代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得反应体系中不同浓度的黄酮样品的吸光值A样品。

1.2.3.2 清除超氧阴离子自由基(O2-·) 取4.5mL pH8.34的50mmol/L的PBS，4.2mL的蒸馏水，混匀后在25℃的水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热的4mmol/L邻苯三酚0.3mL，使溶液的总体积达到9.0mL，测反应启动后30s到3min的A325，计算斜率，为K自氧。

待测液取试剂前，只是在加入邻苯三酚前分别加入不同体积的样品液，蒸馏水减少相应的体积，同时作样品空白以消除样品本身颜色的影响，测定反应体系中不同浓度的黄酮样品反应启动后30s到3min的A325，计算斜率，为K样品。

1.2.3.3 清除亚硝酸盐(NO-2) 取三支25mL的刻度试管a、b、c，准确称取1mL的5μg/mL的NaNO2溶液两份分别加入到a管和c管中，然后吸取一定量的样液，分别加入a管和b管中，反应20min后，a、b、c管中分别加入0.4%的对氨基苯磺酸1.0mL，摇匀反应5min后，再都加入0.2%的N-1-萘乙二胺盐酸盐0.5mL，最后用蒸馏水补充到25mL摇匀静置15min，在最大吸收波长540nm处，以b管为参比管测得a管的吸光度A，以试剂空白为参比测得c管的吸光度为A0。

1.2.4 甘蔗叶总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺

1.2.4.1 样液制备 取一定量甘蔗叶以80%乙醇作为提取剂，料液比为1∶40，在水浴温度60℃、超声功率为104W的条件下超声波提取60min，减压抽滤，得到甘蔗叶黄酮粗提物的醇溶液。将得到的醇溶液旋转蒸发除去醇，然后过滤，去除杂质，得到甘蔗叶黄酮的待纯化液，备用。

1.2.4.2 大孔树脂预处理 取适量树脂，用体积分数为95%的乙醇浸泡24h，湿法装柱，用乙醇洗涤至流出的液体与5BV(树脂床体积)蒸馏水混合不显白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味，然后用5%HCl溶液浸泡2h，用蒸馏水洗至中性;最后用5%NaOH溶液浸泡2h，再用蒸馏水洗至中性，备用。

1.2.4.3 原液浓度对吸附量的影响 取13g树脂装柱，柱床体积为20mL。取浓度不同质量相同的原液，浓度为0.6mg/mL的240mL、浓度为0.9mg/mL的160mL、浓度为1.9mg/mL的76mL、浓度为2.6mg/mL的55mL，1mL/min流速分别上样进行动态吸附，以总黄酮吸附量为考察指标。

吸附量(mg黄酮/g树脂)=［原料液体积×(吸附前浓度-吸附后浓度)］/树脂量

吸附率(%)=［原料液体积×(吸附前浓度-吸附后浓度)］/(原料液体积×吸附前浓度)×100%

1.2.4.4 上样速度对吸附量的影响 同上装柱，取1.9mg/mL原样液76mL，分别以0.5、1、1.5mL/min流速上样，进行动态吸附，考察上样流速对吸附效果的影响。

1.2.4.5 洗脱剂浓度及洗脱体积的选择 将1.9mg/mL上样液80mL，以1mL/min流速分别通过四根层析柱进行动态吸附。各用30%、50%、70%、90%的4种浓度的乙醇以1mL/min流速洗脱，分段收集洗脱液，每份5mL，以洗脱液总黄酮含量为考察指标，绘制洗脱曲线并计算洗脱率。

洗脱率(%)=(洗脱液黄酮浓度×洗脱液体积)/吸附量×100%

2 结果与讨论

2.1 甘蔗叶中总黄酮提取工艺优化

正交实验因素水平表见表1。正交实验结果见表2。从表2的极差分析可以看出，4种因素对提取效果影响大小依次为:乙醇浓度＞超声时间＞提取温度＞料液比。方差分析见表3，结果与极差分析一致，即乙醇浓度影响显著，对结果影响最大。超声时间和提取温度及料液比影响不显著，因此从节约成本提高效率等因素综合考虑，最佳工艺条件为乙醇浓度为80%，提取温度60℃，超声提取时间为60min，料液比1∶40，超声波功率为104W。该工艺制备得到甘蔗叶黄酮含量为22.13mg/g，比正交实验的9组都高。比9组中最高组较为偏高的原因可能是在做验证实验时原料已是残余底料，原料有些不均匀所致。

表2 正交实验设计及极差分析结果

表3 正交实验方差分析

2.2 甘蔗叶黄酮生理活性研究

2.2.1 清除羟自由基作用 由图1可知，甘蔗叶黄酮对羟自由基具有较强的清除作用，而且羟自由基清除率随着黄酮质量浓度的提高而增大。甘蔗叶黄酮清除羟自由基的IC50(清除率为50%时的浓度)为0.038mg/mL，而抗坏血酸清除羟自由基的 IC50为0.042mg/mL，表明甘蔗叶黄酮清除羟自由基的能力高于抗坏血酸。

2.2.2 清除超氧自由基的作用 由图2可知，甘蔗叶黄酮对超氧自由基有一定的清除能力，清除率在一定范围内与黄酮浓度呈正相关性，甘蔗叶黄酮清除超氧阴离子的IC50为0.092mg/mL，而抗坏血酸清除超氧阴离子的IC50为0.04mg/mL。表明甘蔗叶黄酮对超氧阴离子具有一定的清除作用，但作用效果低于同浓度下抗坏血酸的清除能力。

图1 黄酮粗提液对羟自由基的清除作用

图2 黄酮粗提液对超氧阴离子的清除作用

2.2.3 清除亚硝酸盐的作用 由图3可知，反应体系中随着甘蔗叶黄酮含量的增加，对亚硝酸根离子的清除率呈现上升的趋势。甘蔗叶黄酮清除亚硝酸根的IC50为0.12mg/mL，而抗坏血酸清除亚硝酸根的IC50为0.037mg/mL。表明甘蔗叶黄酮对亚硝酸盐具有一定的清除作用，但作用不及抗坏血酸。

图3 黄酮粗提液对亚硝酸盐的清除作用

2.3 AB-8大孔树脂分离纯化工艺的研究

2.3.1 上样液浓度对吸附量的影响 实验结果见表4。由表 4可看出，在低浓度范围，样液浓度由0.6mg/mL增加至1.9mg/mL时，随着上样液浓度的增大，吸附量随之增加。但继续增加样液浓度至2.6mg/mL时吸附量反而下降了，原因是上样液浓度太大，被吸附物质在树脂内部扩散速度变慢，在一定流速下，导致吸附能力下降，所以选择1.9mg/mL有利于吸附。

表4 上样液浓度对吸附量的影响

2.3.2 上样速度对吸附量的影响 由表5看出，流速为0.5mL/min和1mL/min时，甘蔗叶粗提液通过树脂较缓慢，和树脂接触充分，能更好地吸附在树脂上，吸附率较高。当流速为1.5mL/min时，溶质分子来不及扩散吸附到树脂的表面，使吸附率下降，所以选择1mL/min的上样流速为宜。

表5 上样速度对吸附量的影响

2.3.3 洗脱剂用量及洗脱浓度的选择 由图4可知，用70%和90%的乙醇洗脱效果较好，洗脱曲线峰形窄，对称性好，无拖尾现象。由表6可知，70%和90%的乙醇洗脱率都达到了80%以上，而且70%乙醇的洗脱率比90%乙醇更高，故选择70%的乙醇洗脱。而且由图4中70%乙醇的洗脱曲线可知，当洗脱剂用量达到60mL(3BV左右)时，洗脱液中黄酮含量已经接近于零，可认为黄酮已经基本洗脱完全，此时可以停止洗脱。

图4 不同浓度乙醇洗脱剂的洗脱曲线

表6 洗脱剂浓度对洗脱率的影响

3 结论

3.1 利用超声波辅助提取，影响甘蔗叶黄酮化合物浸出的影响因素大小为乙醇浓度＞超声时间＞提取温度＞料液比。甘蔗叶中黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度为 80%，提取温度 60℃，超声提取时间60min，料液比1∶40，超声波功率为104W。

3.2 对甘蔗叶黄酮粗提物进行活性研究表明，甘蔗叶黄酮对羟自由基、超氧自由基和亚硝酸根都具有清除能力。

3.3 甘蔗叶黄酮纯化条件为:AB-8大孔树脂，上样浓度为1.9mg/mL，上样流速为1mL/min，体积为3BV的70%乙醇具有良好的洗脱能力。

［1］保国裕.从甘蔗中提取若干保健品的探讨［J］.甘蔗糖业，2003(2):41-44.

［2］邓家刚，侯小涛，李爱媛，等.甘蔗叶的药效学初步研究［J］.广西中医学院学报，2008，11(3):77-79.

［3］侯小涛，邓家刚，马建凤，等.甘蔗叶提取物的体外抑菌作用研究［J］.华西药学杂志，2010，25(2):161-163.

［4］邓家刚，郭宏伟，侯小涛.甘蔗叶提取物的体外抗肿瘤活性研究［J］.辽宁中医杂志，2010，37(1):32-34.

［5］吴建中，欧仕益，汪勇.甘蔗叶中黄酮类物质的提取及抗氧化性研究［J］.现代食品科技，2009，25(2):165-167.

Extraction，purification and physiological activities of total flavonoids from sugar cane leaves

YAN Yu-xiao，HUANG Yue
(College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China)

Total flavonoids were extracted from sugar cane leaves using ethanol and purified using macroporous adsorption resin.Additionally，the scavenging ability to·OH，O2-· and NO2-were evaluated for the extract product.The results showed that the optimum conditions of extraction were:ethanol concentration 80%，material/ liquid 1∶40，ultrasonic wave extraction 60min at 60℃，ultrasonic power 104W.Under such condition，the extraction of flavonoids from sugarcane leaves was 22.13mg/g.The crude extract product displayed a good scavenging activity to·OH，O2-·and NO2-.The properties of AB-8 resin was good for absorption and desorption of total flavonoids. The optimal purification parameters were as follows:sample concentration 1.9mg/mL，the current velocity 1.0mL/min，taking 70%ethanol as eluent，and eluent quantity 3BV.

sugar cane leaves;flavonoids;ultrasonic wave;physiological avtivities;macroporous resin;extraction and purification

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0149-04

甘蔗(Saccharum sinensis Roxb.)为禾本科植物的茎杆，广植于温带及热带地区，我国南方各省均有栽培。甘蔗叶为甘蔗收获后的副产品，产量很大，每年我国南方各省大量的甘蔗叶并未得到充分利用，除少部分作为动物饲料外，大部分被蔗农就地焚烧，造成资源浪费并严重污染环境。甘蔗叶中除含有大量叶绿素外，还含有维生素C、多糖、黄酮、多酚等多种化学成分，分子量为5000以上的多酚类化合物在甘蔗叶占33%，蔗梢占37%［1］。近年的研究表明，蔗叶提取物有抑制血糖升高的作用［2］，有明显的抑菌作用［3］和体外抗肿瘤作用［4］，采用乙醇回流浸提方法从甘蔗叶中提取出的黄酮物质有较强的抗氧化性能［5］。但甘蔗叶中纤维素物质含量较高，细胞壁结构紧密，采取一般的溶剂萃取法提取率不高，时间长，本研究将超声技术应用于甘蔗叶活性成分提取中，利用超声波的空化作用，加速有效成分的浸出，减少提取时间，提高得率;同时对甘蔗叶黄酮提取物进行活性功能的研究;采用AB-8大孔树脂对甘蔗叶黄酮进行吸附解析实验，研究适宜的纯化工艺，为甘蔗叶资源得到有效利用，变废为宝提供理论依据和技术支持。

2010-08-09

阎欲晓(1970-)，女，研究生，副教授，研究方向:动植物中活性成分分离及性质研究。

广西大学科研基金资助项目(XGL090036)。