吸附-涂层法固定化磷脂酶Lecitase®Ultra的研究

付 敏，赵谋明，*，刘 宁，汪 勇

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510641；2.暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

吸附-涂层法固定化磷脂酶Lecitase®Ultra的研究

付 敏1，赵谋明1，*，刘 宁1，汪 勇2

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510641；2.暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

比较了7种大孔吸附树脂对磷脂酶Lecitase®Ultra的固定化效果，对固定化条件进行了研究。结果表明，极性树脂DA201为该酶的最适固定化载体，在室温下，以pH 7.0，0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液为媒介，加酶量30mg/g树脂，采用正硅酸乙酯对经真空干燥的固定化酶进行涂层处理，通过电镜扫描发现其涂层效果较好。在最适条件下得到的固定化酶活力为1250～1300U/g，连续操作5次后酶活保存率为55%。与游离酶比较，固定化磷脂酶Lecitase®Ultra的热稳定性、pH稳定性均有一定程度的提高。

磷脂酶Lecitase®Ultra，大孔吸附树脂，涂层，固定化，稳定性

Lecitase®Ultra是诺维信公司推出的一种微生物来源的磷脂酶，该酶是一种羧酸酯水解酶，同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性。在一定反应体系中，它会优先表现出其中一种特定的酶活[1]，比如脂肪酶活性。和同类脂肪酶相比，该酶类的脂肪酶活力高，价格便宜，具有很好的应用前景[2]。但由于游离磷脂酶Lecitase®Ultra催化反应时不易回收，条件苛刻，其应用受到了很大的限制。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点，因此成为酶工程领域的热点研究之一[3]。树脂吸附法[4]是上世纪80年代逐渐发展起来的一项新技术，它可通过氢键和疏水作用力与酶分子结合，对酶分子结构影响较小，同时可以维持脂肪酶在非水体系中发挥活性的微环境，大大提高其催化活性，非常适用于脂肪酶类的固定化[5]。磷脂酶Lecitase®Ultra同时具有脂肪酶和磷脂酶活力，其脂肪酶活力方面有着巨大的开发应用前景[6]。本实验着重研究了基于其脂肪酶方面活力的固定化条件，选用大孔吸附树脂进行固定化，对固定化工艺条件进行了研究，并探讨了固定化酶的稳定性，以期为其在生物催化方面的深入应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磷脂酶Lecitase®Ultra 脂肪酶活力3326U/g（测定方法见1.2.4），丹麦诺维信公司；大孔吸附树脂 天津海光化工有限公司；三丁酸甘油酯 东京化成工业株式会社；氢氧化钾、盐酸等试剂 均为分析纯。

754型分光光度计 上海第三分析仪器厂；S20 pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；DZF-6000型真空干燥箱 上海益恒实验仪器有限公司；S-3700N扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 载体树脂的预处理 参考文献[7]的方法进行。

1.2.2 磷脂酶Lecitase®Ultra的固定化 称取一定量的游离磷脂酶Lecitase®Ultra、Tris-HCl缓冲液和大孔吸附树脂，置于磁力搅拌器上恒温吸附4h，过滤分离载体和上清液，将载体真空干燥至恒重后存于-4℃中待用，上清液留待吸附率测定。

1.2.3 载体树脂的蛋白吸附量测定 蛋白质含量采用Folin-酚法测定。吸附量和吸附率的公式分别为：

式中：X1：吸附前酶液的蛋白含量（mg）；X2：吸附后酶液的蛋白含量（mg）；W：加入树脂的量（g）。

1.2.4 固定化磷脂酶Lecitase®Ultra活力的测定 磷脂酶Lecitase®Ultra的脂肪酶活力采用水解三丁酸甘油酯pH-stat法[8]测定。酶活定义为，在一定条件下，1min水解三丁酸甘油酯产生1μmol丁酸所需的酶量，即为一个酶活力单位（U）。

1.2.5 扫描电镜 对固定化酶颗粒喷金后，进行电镜扫描，加速电压为10kV，放大倍率为5000倍。

2 结果与讨论

2.1 固定化载体的选择

选取7种不同特性的树脂作为磷脂酶Lecitase® Ultra的固定化载体。固定化条件为：pH7.0的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，加酶量30mg/g树脂，室温振荡吸附12h，经真空干燥后，测定各树脂的吸附率及固定化酶活力，结果如表1所示。

表1 不同树脂对磷脂酶Lecitase®Ultra的固定化效果

大孔树脂可以借助氢键、范德华力或者功能基团将酶分子固定化，树脂的物理化学性质是影响固定化能力和催化效率的重要因素[5]。由表1可看出，极性树脂DA201的吸附率及吸附固定化所得酶的酶活相对较高。该极性树脂的固定化效果明显优于其他非极性和弱极性树脂的固定化效果，它的比表面积和孔径适中，颗粒均匀，利于固定化和树脂的回收利用。综合考虑，选用DA201树脂作为磷脂酶Lecitase® Ultra的固定化载体。

2.2 磷脂酶Lecitase®Ultra的固定化条件研究

2.2.1 最适固定化pH的研究 在特定的pH下，酶分子上的活性基团才能处于最佳的解离状态，呈现较好的催化活力。本实验研究了不同pH的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液对固定化酶的酶活及吸附率的影响，结果如图1所示。可以看出，随着pH不断上升，酶活及吸附率先缓慢升高，在pH为7.0时，达到最高，随后随着pH上升又缓慢下降。因此最终选择pH7.0作为酶固定化的最适pH。

图1 不同pH对酶活和吸附率的影响

2.2.2 最适加酶量的研究 实验研究了加酶量对固定化磷脂酶Lecitase®Ultra活力及吸附率的影响，结果如图2所示。随着加酶量的增加，吸附率呈上升的趋势，当加酶量达到30mg/g树脂时吸附率最高，随着加酶量的继续增加，吸附率下降。而酶活在30mg/g树脂时同时达到最高，随后逐渐趋于恒定。可能原因是加酶量较少时，吸附酶量较低，则酶活力低；当被吸附酶液浓度升高，酶分子吸附较多，固定化酶活也变大；随着加酶量进一步增加，树脂孔道被“堵塞”，产生了空间位阻，固定化酶活也就趋于恒定[9]。综合考虑，选取30mg/g树脂为最适加酶量。

图2 不同加酶量对酶活和吸附率的影响

2.2.3 固定化酶的交联或涂层处理研究 本实验分别采用戊二醛、正硅酸乙酯对经真空干燥的固定化酶进行交联或涂层处理，以提高其操作稳定性。其中戊二醛和正硅酸乙酯的浓度分别为0.1%和30%[10]。经上述处理后，固定化酶真空干燥，再对其进行电镜扫描，结果如图3所示。由图可知，较对照组而言，交联或涂层处理对固定化酶的表面改性均较明显。通过酶活测定发现，经交联或涂层后固定化酶的酶活分别降低了18%和10%左右，这可能是外加处理损失了一定的酶活。相对交联法而言，涂层法对酶有一定的包裹保护作用，酶活损失较小一些。

图3 不同处理方式下固定化酶的扫描电镜图

2.3 固定化酶的稳定性研究

2.3.1 不同处理方式下固定化酶操作稳定性的研究以对照组的固定化酶活为100%，测定连续使用5次后的相对酶活，结果如图4所示。可以发现，在重复使用过程中，经戊二醛交联处理或正硅酸乙酯涂层处理的固定化酶的操作稳定性明显优于对照组。正硅酸乙酯涂层处理的效果更好，重复使用5次之后，仍然保有55%左右的酶活，而戊二醛交联和对照组只有初始酶活的25%。主要原因是，经正硅酸乙酯涂层处理，吸附在树脂孔隙中的酶被包裹在正硅酸乙酯所形成的涂层里（见图3-C），使用过程中不易脱落下来[10]，从而具备较好的操作稳定性。因此，最终确定吸附-涂层法对磷脂酶Lecitase®Ultra进行固定化处理。经测定，此法得到的固定化磷脂酶Lecitase® Ultra的酶活为1250～1300U/g。

图4 不同处理方法对固定化酶操作稳定性的影响

图5 固定化酶和游离酶的热稳定性

2.3.2 固定化酶的热稳定性研究 分别将游离酶和固定化酶在不同温度下处理1h，定义未经热处理的酶活为100%，各相对酶活变化如图5所示。由图可知，固定化之后，酶的耐热性能更好，在55℃下处理1h仍能保持60%左右的酶活，从而可使一些需要在相对较高温的环境中反应的实验得以进行。在低于45℃对游离酶和固定化酶进行保温处理，酶活力损失较少；高于45℃对游离酶和固定化酶进行保温处理，酶活力则呈明显下降趋势，游离酶活力下降十分迅速。这主要是由于固定化稳定了酶分子构象，从而减少了热导致构象变化的可能性[11]，大孔吸附树脂的保护作用也在一定程度上屏蔽了高温对磷脂酶Lecitase®Ultra的影响，提高了酶分子的抗热失活能力。2.3.3 固定化酶的pH稳定性研究 在相同条件下分别将游离酶和固定化酶在不同pH下处理2h，定义未经处理的酶活为100%，各相对酶活变化如图6所示。由图可知，固定化之后酶的pH稳定性提高，耐酸碱范围变宽。游离酶在高于pH6.5体系处理后，酶活急剧下降；而固定化酶在高于pH7.5环境处理后，依然保持较高的酶活。整体看来，固定化酶的pH稳定性优于游离酶，且能耐受稍碱性的环境。这是因为，酶在固定化以后，酶活性中心氨基酸带电情况发生了变化，从而影响了酶的活性[12]，因此利于某些特定条件下的使用，扩大了其实际应用范围。

图6 固定化酶和游离酶的pH稳定性

3 结论

以大孔吸附树脂DA201为载体，对磷脂酶Lecitase® Ultra进行吸附法固定化，具体方法为：室温下，以pH7.0 0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液为媒介，加酶量30mg/g树脂，吸附时间4h。真空干燥后，用正硅酸乙酯涂层处理，可得到固定化酶的酶活为1250～1300U/g。重复使用5次后，酶活回收率可达55%。固定化酶较游离酶具有更广泛的应用条件，热稳定性增强，适用pH范围增大，从而扩大了磷脂酶Lecitase®Ultra的使用效率和应用范围。

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Immobilization of Lecitase®Ultra by adsorption-coating method and its properties

FU Min1,ZHAO Mou-ming1，*,LIU Ning1,WANG Yong2
（1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China；2.Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China）

Seven kinds of macroporous resin were employed to immobilize phospholipase Lecitase®Ultra，and the immobilization conditions were studied.The results indicated that DA201 was the best carrier.The optimum operation conditions were:under room temperature，pH 7.0 Tris-HCl（0.01mol/L），enzyme dosage 30mg/g resin.Tetraethyl orthosilicate was then used as the coating reagent for immobilized enzyme by the vacuum drying，which showed an effective coating effect through scanning electron microscope.Under optimized conditions，the immobilized Lecitase®Ultra with enzyme activity of 1250～1300U/g could be obtained，and it could remain 55%enzyme activity after continuous operation for 5 times.Compared with free Lecitase®Ultra，there was a certain extent improvement for the thermal stability and pH stability of immobilized Lecitase®Ultra. Key words：Lecitase®Ultra；macroporous adsorption resin；coating；immobilization；stability

TS201.2+5

B

1002-0306（2011）10-0277-04

2010－11－19 *通讯联系人

付敏（1989-），女，硕士研究生，研究方向:食品生物技术。

国家863计划项目（2010AA101505）；国家自然科学基金（31000793）。