H2O2催化预处理对玉米芯酶解的影响

王晓辉，王文雅，*，袁其朋，欧阳艳

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029；2.伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆伊宁835000）

H2O2催化预处理对玉米芯酶解的影响

王晓辉1，王文雅1，*，袁其朋1，欧阳艳2

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029；2.伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆伊宁835000）

木糖通常经半纤维素水解而得，而富含半纤维素的玉米芯细胞中同时也含有木质素与纤维素，与半纤维素紧密缠绕，阻碍了其水解，因此预处理便成了生产木糖过程中的一个必要的步骤。经实验优化所得预处理最佳工艺条件为：室温，固-液比1∶20，pH5.0，H2O2量3.05%，Fe2+添加量0.15g，处理时间2.56h。在此条件下H2O2催化预处理后，用木聚糖酶进行酶解，木糖和葡萄糖得率分别比未处理的0.1895、0.1672g/g玉米芯提高到0.2676、0.2930g/g玉米芯。而经木聚糖酶和纤维素酶（双酶）进行酶解后又分别提高到0.2856、0.3321g/g玉米芯，证明H2O2催化预处理是一种有效可行的预处理方法。

H2O2，Fe2+，预处理，木糖

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米芯 购于北京郊区，自然风干的玉米芯粉碎至20目后，用挤压机进行挤压膨化，再在室内风干，玉米芯样品中纤维素含量为38.4%，半纤维素含量为32.4%，木质素含量为9.2%；木聚糖酶 酶活力6000万U/g，湖州礼来公司；纤维素酶 酶活力6000万U/g，夏盛公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验工艺流程 玉米芯→挤压膨化、风干→H2O2催化预处理→洗涤过滤、烘干滤渣→酶解→过滤、测滤液中的单糖。

其中H2O2催化预处理为影响酶解产率的关键步骤，对其进行了如下优化实验，以确定最佳条件。

1.2.2 玉米芯的H2O2预处理单因素实验 在锥形瓶中加入一定量的玉米芯和H2O2溶液，温度25～100℃，固-液比1∶10～1∶40，pH3.0～7.0，时间1～24h，分别进行预处理后抽滤，分离处理试样与溶液，用去离子水洗涤处理试样残渣，60℃下干燥至恒重，储存待后续酶解及成分测定。

在以上确定的最佳条件下，在玉米芯中加入Fe2+0.01～0.25g，并将时间缩短为10～180min，分别进行预处理后抽滤，分离处理试样与溶液，用去离子水洗涤处理试样残渣，60℃下干燥至恒重，储存待后续酶解及成分测定。

1.2.3 玉米芯的酶解糖化 为判定不同预处理条件对后续木聚糖酶降解玉米芯的过程产生的影响，对各试样进行了酶水解反应。采用柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（pH=4.8）将固体木聚糖酶在45℃水浴中溶解，酶浓度为50g/L。在45℃，200r/min恒温摇床内反应72h后过滤，测定其中单糖产量。

首先，严格落实统一供种、统一水肥管理、统一技术指导、统一病虫害防治、统一机械化操作的五统一技术路线，确保整个示范区内各项工作的统一性。同时还要在示范区内明确标志示范牌，示范牌要详细注明创建单位、主导品种、产量目标和关键生产技术。同时还要确保有专业技术人员负责，有专业配套措施扶持，定期开展观摩示范活动计划，有效发挥示范区的宣传示范带动作用。

为判定双酶酶解结果，在上述酶解条件下加入纤维素酶进行反应，酶浓度为50g/L，其它条件同上。过滤后测滤液中的单糖产量。酶解条件由一系列单因素实验获得。

1.2.4 响应曲面（RSM）实验 借助于design expert软件，根据box-behnken设计，采用3因素3水平共17个实验点（因素水平见表1）进行响应面分析。

表1 响应面因素水平表

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 玉米芯成分测定 原理为Van Soest法，还原糖的分析采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法，单糖用高效液相色谱分析。柱型号：COSMOSIL Sugar-D；规格：5μm×4.6mm×250mm；流动相：乙腈∶水=75∶25；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测器：蒸散光检测器。

1.2.5.2 扫描电镜分析 将未处理的玉米芯和H2O2催化预处理的玉米芯样品用导电胶带固定在铜台上，喷金后用JSM.6360LV扫描电子显微镜观察。

1.2.5.3 红外分析 采用傅立叶变换红外光谱仪对未处理的玉米芯和H2O2催化预处理的玉米芯样品进行红外光谱分析。

1.2.6 计算方法 酶解单糖得率=反应生成的单糖浓度×体积/玉米芯质量

2 结果与分析

2.1 玉米芯的H2O2预处理单因素实验

2.1.1 预处理中H2O2量对玉米芯成分及酶解的影响不同体积分数的H2O2预处理后的玉米芯木质素成分分析和酶解糖化结果见表2。由表2的数据分析可知，随着预处理H2O2体积分数的增大，玉米芯的失重率升高，而酶解后糖化率也升高。H2O2预处理对木质素的氧化降解程度明显，而纤维素与半纤维素的损失率非常小。综合考虑木质素降解量与酶解糖得率，确定H2O2体积分数为3%时最佳。

表2 不同体积分数的H2O2预处理结果

2.1.2 温度对酶解单糖得率的影响 随温度的升高，酶解所得单糖量减少，分析原因可能是温度较高时H2O2不稳定，分解为H2O和O2，从而使其对木质素的氧化降解作用基本消失。

表3 不同温度H2O2预处理结果（g/g玉米芯）

2.1.3 H2O2预处理固-液比对酶解的影响 随着固-液比的增加，单糖得率有明显提高，但增加到一定程度单糖得率开始缓慢降低，且固-液比太大会使多余的H2O2无效分解，造成浪费。当固-液比为1∶20时，单糖得率最高。

图1 单糖产量随固液比的变化

2.1.4 pH与时间的影响 H2O2对木质纤维素的氧化过程，是H2O2对木质素进行氧化降解和H2O2发生无效分解两个相竞争的过程。中性和酸性条件下H2O2相对较稳定，在pH3.0、4.0、5.0、7.0下对玉米芯进行H2O2预处理1、2、3、4、5、12、24h后，由结果可知，pH5.0、处理3h时单糖得率最高。

图2 单糖产量随pH和时间的变化

2.1.5 Fe2+添加量 Fe2+/H2O2体系可以方便地产生羟基自由基（·OH）：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH，所产生的羟基自由基（·OH）的反应活性远高于过氧化氢本身的反应活性。由图可知，随着Fe2+添加量的增加，玉米芯的酶解单糖得率增加，但增加到一定程度会使玉米芯迅速变为褐色，并伴有明显的放热反应，表明玉米芯H2O2氧化程度过大。单因素实验结果表明，Fe2+添加量为0.15g时单糖得率最高。

图3 单糖产量随Fe2+添加量的变化

2.1.6 Fe2+处理时间 由图可知，加入Fe2+催化剂之后单糖得率增加，且最佳处理时间也有所缩短。单因素实验结果表明，Fe2+添加量为0.15g、处理时间为2.5h时木糖得率最高，处理时间2h时葡萄糖得率最高。

图4 单糖产量随催化预处理时间的变化

2.2 双酶酶解结果

图5 单酶与双酶酶解结果比较

玉米芯经H2O2处理后单糖得率明显提高，用木聚糖酶酶解后木糖和葡萄糖得率分别比未处理的0.1895、0.1672g/g玉米芯提高到0.2676、0.2930g/g玉米芯，而经双酶酶解后又分别提高到0.2856、0.3321g/ g玉米芯。

2.3 响应曲面（RSM）分析

响应面分析（RSA）法采用多元二次回归方程作为函数估计的工具，将多因子实验中因素与指标的相互关系用多项式表达，以此可对函数的响应值和等值线进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系[9-10]。实验分析方案与结果见表4。

表4 响应面分析方案与结果

由Design-Expert软件分析，将H2O2浓度、Fe2+添加量、处理时间三个参数分别固定，木糖得率随其余两个参数变化的响应面图见图6。

图6 木糖得率随参数变化的响应面图

表5 回归方差分析结果

用Design-Expert软件的RSM分析系统对所得数据进行回归分析，得到木糖得率的回归方程为：

Y=28.53-0.15A+0.32B+0.17C-0.33AB+0.21AC+ 0.31BC-0.99A2-1.62B2-1.83C2。从回归方程的方差分析（表5）中可以看出，用上述回归方程描述各因子与响应值之间的变化关系时，其因变量与所有自变量之间的关系是显著的，相关系数R2=93.24%，方程的F值为10.73，显著系数为0.0025，说明方程是显著的。

由RSM分析系统得出实际的最佳预处理条件下的方程为：Y’=-37.31350+136.145A+33.0875B+8.9685C-13.2AB+4.25AC+0.615BC-396.4A2-6.464B2-1.8285C2

为了进一步确证最佳的预处理条件，将Y’方程分别对A、B、C求一阶偏导并使其等于零，用Matlab进行数据运算，解此方程组得到A=0.15，B=2.56，C=3.05，即预处理最佳工艺条件：Fe2+添加量为0.15g，处理时间2.56h，H2O2量为3.05%，可求得木糖得率为28.5609%，即0.2856g/g玉米芯。

2.4 H2O2催化预处理对玉米芯表观形态的影响

由图7可见，未处理20目玉米芯表面平整光滑，结构比较紧密，孔隙度不高。

图7 未处理玉米芯

图8为H2O2催化预处理后的20目玉米芯，可见经预处理之后玉米芯表面结构发生了很明显的变化，表面出现裂痕剥落，断面开裂分层，结构蓬松，且孔隙度大为提高，这使玉米芯的比表面积增加，充分说明了H2O2催化预处理后玉米芯更易于酶的进攻，有利于提高酶解单糖得率。

图8 H2O2/Fe2+催化处理玉米芯

2.5 H2O2催化预处理对玉米芯内部结构的影响

图9 红外分析图谱

3420～3430cm-1处的吸收峰为醇和酚分子中的OH宽峰振动；2921cm-1处的吸收峰为CH3和CH2的CH对称和反对称振动；1633cm-1处的吸收峰为木质素C=C伸展振动；1602cm-1处的吸收峰为芳香环C=C键；1515cm-1处的吸收峰为木质素苯环伸展振动；1463cm-1处的吸收峰为木质素和聚木糖CH2弯曲振动、木质素苯环振动；1265cm-1处的吸收峰为苯环骨架振动、愈创木基型C=O伸缩振动；1170cm-1处的吸收峰为纤维素和半纤维素中C-O-C的振动；1117～1124cm-1处的吸收峰为C-H苯环、紫丁香型C-H振动。这些吸收峰强度经H2O2处理后都有所减弱，说明经H2O2处理后木质素部分降解溶出。

3 结论

本研究在已获取最佳酶解处理条件的基础上进行了与酶解处理相结合的Fe2+/H2O2预处理条件的优化实验。预处理条件的优化分别从温度、H2O2体积分数、固-液比、pH、预处理时间、Fe2+添加量等几个方面来进行，并对其中相互影响较大的三个因素用响应面进行进一步优化。RSM实验分析结果表明，在室温、pH5.0、H2O2体积分数为3.05%、固-液比为1∶20、预处理时间为2.56h、Fe2+添加量为0.16g的条件下，预处理的玉米芯的酶解产木糖量可达到0.2856g/g。

通过电镜和红外图谱分析可知，经Fe2+/H2O2预处理后的玉米芯因部分木质素的氧化降解溶出而表面出现裂痕剥落，断面开裂分层，结构蓬松，孔隙度大大提高，使酶更易于与玉米芯半纤维素接触，提高木糖产率，且使酶用量减少了10%，更有利于工业生产的可持续发展。

本实验优化出与酶解处理法相结合的、廉价的Fe2+/H2O2预处理方法，为木糖的工业生产提供了低成本、高效率的预处理工艺，具有较好的应用前景。

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Effect of catalyzed H2O2pretreatment on the enzymatic hydrolysis of corn cob

WANG Xiao-hui1,WANG Wen-ya1，*,YUAN Qi-peng1,OUYANG Yan2
（1.Life Science and Technology Institute,Beijing University of Chemical,Beijing 100029，China；2.Chemical and Bio-science Institute,Yili Normal University,Yining 835000，China）

Xylose is usually obtained by the hydrolysis of hemi-cellulose.But the existing of lignin and cellulose，which are intertwining with hemi-cellulose in corn cob hinders the hydrolyzing process.So pretreatment becomes a necessary procedure for xylose producing.The optimized conditions were obtained as follow:room temperature，solid-to-liquid ratio was 1∶20，pH5.0，H2O2concentration was 3.05%，additive amount of Fe2+was 0.15g，and pretreatment time was 2.56h.After this catalyzed H2O2pretreatment，the xylanase hydrolysis yield of xylose and glucose had reached 0.2676，0.2930g/g corncob，and the yield of un-pretreated corncob was 0.1895，0.1672g/g.While cellulase was added，the yield of xylose and glucose came up to 0.2856，0.3321g/g.It was proved that catalyzed H2O2pretreatment was an effective and feasible pretreatment.

H2O2；Fe2+；pretreatment；xylose

TS210.1

B

1002-0306（2011）10-0268-05

2010－11－09 *通讯联系人

王晓辉（1984-），女，硕士研究生，研究方向：生物质预处理。

国家高技术研究发展计划（863）（2009AA02Z202）；中央高校基本科研业务费项目（ZZ1026）；新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2008I32）。