少孢根霉发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元

孙 强，孙洁心，张永忠

(1.黑龙江农垦职业学院，黑龙江哈尔滨150025; 2.东北农业大学应用化学系，黑龙江哈尔滨150030; 3.教育部大豆生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

少孢根霉发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元

孙 强1，孙洁心1，张永忠2，3，*

(1.黑龙江农垦职业学院，黑龙江哈尔滨150025; 2.东北农业大学应用化学系，黑龙江哈尔滨150030; 3.教育部大豆生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

研究了以少孢根霉作为菌种对豆粕进行发酵生产大豆异黄酮苷元的方法，通过单因素实验和正交实验确定了发酵的最佳培养基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸，最佳发酵条件是发酵时间24h，发酵温度30℃。在此条件下，黄豆苷元转化率为90.95%，染料木黄酮转化率为92.24%。为豆粕的综合利用和大豆异黄酮苷元的产业化生产提供参考。

少孢根霉，固态发酵法，大豆异黄酮苷元，高效液相色谱

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆豆粕 哈高科大豆食品有限责任公司;少孢根霉(CCTCC AF 96004) 由东北农业大学生命学院微生物实验室提供;斜面菌种保藏培养基和菌种扩培培养基 均为PDA培养基;染料木黄酮、黄豆苷元、染料木苷和黄豆苷标准品 sigma公司;甲醇色谱纯;冰醋酸等 国产分析纯试剂。

高效液相色谱仪 含P682HPLC泵、UVD170U紫外检测器、ASI-100自动进样器、色谱柱Nova-Pak C18柱(3.9×150mm 4μm)，美国戴安公司;电子天平上海天平仪器厂;H.H.S 21-2R型电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂;DH600A型电热恒温培养箱天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量 测定条件：流动相为甲醇∶0.5%乙酸=40∶60(v/v)，柱温：50℃，流速：1.0mL/min，检测波长：254nm，进样量：10μL。

标准曲线的绘制：分别精密称取标准品染料木苷(genistin)和黄豆苷(daidzin)各1mg、染料木黄酮(genistein)和黄豆苷元(daidzein)各5mg，用甲醇分别定容到10mL容量瓶中，制成标准储备液。然后分别从各标准储备液中吸取一定量，用甲醇稀释到1、2、3、4、5μg/mL待测。以峰面积(y)为纵坐标，大豆异黄酮浓度(x)为横坐标，对各组分浓度与峰面积关系进行回归分析，分别绘制标准曲线。

1.2.2 空白实验 准确称量豆粕，加入4倍水，在0.08MPa灭菌20min。用80%乙醇常温下在磁力搅拌条件下提取30min，料液比 1∶4，提取2次，在4000r/min离心并合并提取液，定容至50mL，稀释后过滤，用高效液相色谱法检测得到发酵前豆粕中大豆异黄酮糖苷和苷元含量，三组平行数据取平均值。

1.2.3 发酵提取路线 准确称量豆粕，加入碳源、无机盐等，加入4倍水，在0.08MPa灭菌20min，加入0.8%乳酸，拌匀。加入孢子菌悬液，在恒温箱中30℃恒温培养24h。用80%乙醇常温下在磁力搅拌条件下提取30min，料液比1∶4，提取2次，在4000r/min离心并合并提取液，定容至50mL，稀释后过滤，用高效液相色谱法检测，计算异黄酮苷元的转化率

转化率(%)=发酵前后异黄酮苷元质量之差/发酵前大豆异黄酮糖苷质量×100%

1.2.4 孢子菌悬液的制备 接种少孢根霉于固体平板培养基上，在恒温箱中30℃恒温培养72h，用无菌生理盐水洗下孢子，稀释至106cfu/mL，放置于冰箱中4℃备用。

1.2.5 最佳发酵培养基的确定

1.2.5.1 碳源的选择 分别加入10%葡萄糖、蔗糖和淀粉，按照1.2.3发酵提取，根据异黄酮苷元的转化率选择最佳碳源。

1.2.5.2 碳源添加量的确定 分别添加5%、10%、15%最佳碳源，按照1.2.3发酵提取，根据异黄酮苷元的转化率选择碳源添加量。

1.2.5.3 无机盐及其添加量的确定 通过四因素三水平正交实验确定添加无机盐及其最佳添加量，因素水平如表1所示。

表1 无机盐正交实验因素表

1.2.5.4 水分比例的选择 分别使发酵培养基中干料与水分比例为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，按照1.2.3发酵提取，根据异黄酮苷元的转化率选择最佳水分比例。

1.2.6 最佳发酵条件的确定

1.2.6.1 发酵时间的选择 选用最佳发酵培养基，在恒温箱中30℃分别恒温培养18、24、30、36h，用1.2.3中条件提取检测，根据异黄酮苷元转化率确定最佳发酵时间。

1.2.6.2 发酵温度的选择 选用最佳发酵培养基，分别在28、30、37、40℃恒温培养，用1.2.3中条件提取检测，根据异黄酮苷元转化率确定最佳发酵温度。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法测定大豆异黄酮标准曲线

表2 标准曲线(y-峰面积x-化合物浓度)

2.2 空白实验结果

用HPLC法检测发酵前豆粕中大豆异黄酮糖苷和苷元含量，三组平行数据取平均值。结果如表3所示。

表3 豆粕中异黄酮的含量(μg/g)

由表3可知，豆粕中大豆异黄酮主要以糖苷形式为主，苷元形式的异黄酮约占异黄酮总量的4%左右。

2.3 最佳发酵培养基的确定

2.3.1 最佳碳源的测定 分别加入10%葡萄糖、蔗糖和淀粉，发酵提取后，HPLC法检测黄豆苷元和染料木黄酮结果如图1所示。

图1 不同碳源对异黄酮苷元转化率影响的比较

由图1可以看出，在不加入其他碳源的情况下最高。在加入葡萄糖的条件下，少孢根霉直接利用葡萄糖作为碳源，而降低了对异黄酮糖苷中糖苷基的利用率，所以对异黄酮苷元的转化率没有积极的影响。因此选择的条件为不加入其他碳源，此时黄豆苷元的转化率是72.92%，染料木黄酮的转化率为74.64%。

2.3.2 无机盐及其添加量的确定 通过4因素3水平正交实验，HPLC法检测结果如表4所示。

表4 无机盐正交实验结果分析表

由表4可以看出，不加入无机盐的情况下异黄酮苷元的转化率最高。通过极差分析可以看出，四因素对于异黄酮苷元转化率的影响程度依次为B＞C＞D＞A。加入无机盐对异黄酮苷元的转化率没有积极影响，因此选用条件为不加入无机盐。

2.3.3 水分比例的确定 分别使发酵培养基中干料与水分比例为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，HPLC法检测黄豆苷元和染料木黄酮结果如图2所示。

图2 不同水分比例的比较

由图2可以看出，培养基中干料与水分比例为1∶3时异黄酮苷元转化率最高。水分比例为1∶2时，不利于微生物生长繁殖;少孢根霉是需氧菌，水分过多不利于菌在培养基内部的生长。因此，当水分比例为1∶3时为最佳培养基条件。

2.4 最佳发酵条件的确定

2.4.1 发酵时间的选择 选用最佳发酵培养基，在恒温箱中30℃分别恒温培养18、24、30、36h，HPLC法检测黄豆苷元和染料木黄酮结果如图3所示。

由图3可知，在发酵24h后，黄豆苷元和染料木黄酮的转化率变化很小。因此选择发酵时间为24h。

2.4.2 发酵温度的选择 选用最佳发酵培养基，分别在28、30、37、40℃恒温培养，HPLC法检测黄豆苷元和染料木黄酮结果见图4。

图3 不同发酵时间的比较

图4 不同发酵温度的比较

由图4可知，在30℃发酵，黄豆苷元和染料木黄酮的转化率最高，在37℃和40℃转化率均降低。因此选择30℃为最佳发酵温度。

发酵后，豆粕中异黄酮的含量如表5所示。

表5 发酵后豆粕中异黄酮的含量(μg/g)

由表5可以看出，发酵后苷元形式的大豆异黄酮含量大幅度升高。说明发酵过程使糖苷形式异黄酮转化为苷元形式的异黄酮，此条件下黄豆苷元转化率为92.24%，染料木黄酮转化率为92.24%。

3 结论

本实验通过单因素实验和正交实验优选出少孢根霉发酵豆粕的最佳发酵培养基和最佳发酵条件，确定少孢根霉发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元的最佳发酵培养基是豆粕∶水=1∶3，0.8%乳酸。最佳发酵条件是发酵时间24h，发酵温度30℃。此条件下黄豆苷元转化率为90.95%，染料木黄酮转化率为92.24%。微生物发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元及其提取分离的研究，对综合利用豆粕资源、提高其附加值具有重要的意义，也为豆粕的综合利用开辟一条新途径。

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Study on the solid fermentation in producing of soybean isoflavone glycoside by Rhizopusolig osporus saito

SUN Qiang1，SUN Jie-xin1，ZHANG Yong-zhong2，3，*
(1.Heilongjiang Nongken Vocational College，Harbin 150025，China; 2.Department of Applied Chemistry，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 3.Key Laboratory of Soybean Biology，Ministry of Education，Harbin 150030，China)

The experiment was designed to study the method of isoflavone preparation by fermentation on soybean residue.According to the single factors and the orthogonal test，it showed that the optimal substrate was the soybean-water ratio 1∶3 and 0.8%lactic acid，the optimal fermentation conditions was the total time 24h and the temperature 30℃.The transformation ratio of daidzein was 90.95%，and the transformation ratio of genistein was 92.24%under the conditions.It was the reference resources for integrated utilization of soybean residue and production of isoflavone glycoside.

Rhizopusolig osporus saito;solid fermentation;soybean isoflavone glycoside;HPLC

TS201.3

A

1002-0306(2011)12-0258-04

大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有12种，可以分为3类，即黄豆苷类(Daidzin Groups)、染料木苷类(GenistinGroups)、大豆黄素苷类 (Glycitin Groups)，以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在［1］。大豆异黄酮中97%～99%是以大豆异黄酮糖苷形式存在，苷元形式仅为大豆异黄酮总量的1%～3%［2］。很多调查研究报道以及动物实验表明，大豆异黄酮具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、妇女更年期综合症等多种疾病，尤其是对乳腺癌和前列腺癌有积极的预防和治疗作用［3-7］。一般认为苷元(主要是genistein和daidzein)是大豆异黄酮的主要活性组分。也就是说，大豆异黄酮的苷元形式比糖苷形式活性要高，特别是染料木黄酮(genistein)的活性更高［8-9］。食品中的异黄酮主要以糖苷的形式存在，生物体一般不吸收此种形式［10］。大豆异黄酮糖苷在人的消化酶(特别是β-葡萄糖苷酶)作用下水解成其苷元形式，才开始被吸收［11］。目前大豆异黄酮糖苷水解的常用方法有：酸水解法、碱水解法和酶水解法等［12-13］。利用微生物发酵的方法生产大豆异黄酮，和化学合成、提取法相比，不但可以使产量大大增加，而且还可以降低成本，更具有吸引力的是能直接生产苷元［14］。发酵法制备大豆异黄酮苷元具有成本低、适合工业化生产的优点［15］。而且发酵不影响异黄酮的含量，但改变了异黄酮种类的分布。这是因为在发酵过程中，真菌产生的大量β-葡萄糖苷酶使异黄酮葡萄糖苷大量水解，从而导致游离型的异黄酮显著增加［16］。本研究旨在确定少孢根霉发酵豆粕制备大豆异黄酮苷元的最佳条件，以求为发酵法制备大豆异黄酮苷元的工业化，为生产低成本、富含大豆异黄酮苷元的产品开辟途径。

2010-09-17 *通讯联系人

孙强(1979-)，男，讲师，硕士，研究方向:粮食油脂与植物蛋白工程。

国家高技术研究发展计划(863计划)(2008AA10Z331)。