重组海带面产品中腐败微生物的分离纯化及种类鉴定

王雅萍，曹 荣，江艳华，刘 淇，*，殷邦忠，姜 桥

(1.青岛农业大学，食品科学与工程学院，山东青岛266109; 2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071)

重组海带面产品中腐败微生物的分离纯化及种类鉴定

王雅萍1，2，曹 荣2，江艳华2，刘 淇2，*，殷邦忠2，姜 桥1

(1.青岛农业大学，食品科学与工程学院，山东青岛266109; 2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071)

以新型重组海带面产品为研究对象，对其贮藏过程中的腐败微生物进行了分离、纯化，并通过菌落形态观察、生理生化初步鉴别、VITEK微生物全自动系统分析对其种类进行了鉴定。结果表明，导致重组海带面产品腐败的微生物为产芽孢菌，分离到的6株菌分别为:短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、枝芽孢杆菌(Virgibacillus proomii)、溶淀粉芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)和缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)。

重组海带面，腐败菌，鉴定

1 材料与方法

1.1 材料与设备

实验用海带原料 由山东荣成海之宝海洋科技有限公司提供;平板计数培养基、革兰氏染色试剂盒等 均购于青岛海博生物技术有限公司。

SPX－250BSH－II型生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;SW－CJ－IFD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;BX－51型显微镜OLYMPUS;MLS－3780型高压蒸汽灭菌锅 SANYO; VITEK全自动微生物分析系统 Bios Merieumx。

1.2 实验方法

1.2.1 重组海带面产品的加工工艺 海带原料→清洗脱盐→破碎浆化→挤压成型→固化护色→熟化→清洗→包装→巴氏杀菌→成品

主要操作流程:a.将选取的海带原料清洗，去除海带表面污泥及粘液，清水中浸泡脱盐，捞出沥水;b.海带经匀浆机破碎后，加入3%草酸钠混合，用胶体磨研磨制成浆状胶体;c.采用真空挤压脱除浆状胶体中的气体，通过成型模具连续挤出条状物;d.将条状物置于固化护色复合液(0.5%柠檬酸钙，0.2%草酸镁)中，室温浸泡15s;e.固化后的海带面加入碳酸钠，搅拌处理5min;f.清水冲洗海带面，去除多余的碳酸钠。

1.2.2 腐败菌的分离和纯化 在无菌条件下，取腐败变质的海带面样品10.0g，剪碎后匀浆，加90mL无菌生理盐水制成10－l稀释液，用10倍递增法进一步制成10－2、10－3和10－4等稀释度的稀释液，取100μL各稀释度的稀释液涂布营养琼脂(NaCl质量分数调整为3%)平板，置于30℃恒温培养箱中培养，48h后选取合适的计数平板，从平板上挑取菌落，划线分离后保存在试管斜面中。

1.2.3 腐败菌的鉴定 将1.2.2中分离到的菌株活化复壮后，观察其菌落特征，进行革兰氏染色、过氧化氢酶等生化实验［6］，对菌株进行初步鉴定。

挑取培养24h后的菌落置于3%的无菌NaCl溶液中，配成比浊度为 2.0左右的稀释菌液，采用VITEK微生物自动鉴定系统进行鉴定，即将芽孢试卡的L型吸管插入菌液中，利用真空原理将菌液吸入每个生化反应小室内，将底物溶解并封口，试卡置于培养箱内，由系统自动检测、分析数据并给出鉴定结果［7］。

2 结果与分析

2.1 腐败菌的分离纯化

实验对三批海带面产品腐败后的微生物情况进行了分析，从分离到的菌株中筛选了6株具有代表性的细菌，其编号和菌落形态如表1所示。

表1 重组海带面产品中分离到的各菌株形态特征

2.2 腐败菌的初步鉴定

6株细菌革兰氏染色后的形态如图1所示，6株菌均为革兰氏阳性菌，可以明显观察到芽孢存在，同时过氧化氢酶实验表现为阳性，初步鉴定为芽孢菌。

表2 菌落初步鉴定结果

2.3 生化鉴定结果

根据初检结果确定分离到的6株细菌均为产芽孢菌，因此选用BAC芽孢试卡，采用VITEK系统对6株菌的生理生化性质进行分析，结果见表3。最终鉴定结果见表4，6株菌分别为短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、枝芽孢杆菌(Virgibacillus proomii)、溶淀粉芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)和缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)。

图1 革兰氏染色后的显微镜观察图片(1000×)

表4 重组海带面产品中分离的细菌的鉴定结果

3 结论与讨论

微生物是食品卫生检验与监控的重要对象之一。食品中的微生物多种多样，在加工过程中，如何能快速、高效、安全地杀灭微生物是企业生产及质量监控的关键。重组海带面产品中微生物的种类和数量与原料和生产环境密切相关。巴氏杀菌虽然可以在很大程度上将产品中的绝大多数微生物杀灭，但某些嗜热性微生物却能在极端环境下存活下来，在适宜的条件下迅速生长繁殖，导致产品的腐败变质［8］。目前对于软包装罐藏食品中主要腐败菌种类有较多研究报道，如乔华林等［9］指出在轻微加工保藏的水产品中，能够引起腐败的微生物主要是革兰氏阳性菌。相关研究也表明，造成罐藏食品酸败的微生物通常是嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)和 凝 结 芽 孢 杆 菌 (Bacillus coagulans)［10］。目前对于海带产品中腐败微生物的研究报道较少。唐勇等［11］人曾对真空包装的熟食海带软罐头进行了部分研究，认为产品经单纯的巴氏杀菌放置一段时间后，菌落总数增殖幅度很大，防腐不稳定。刘秀河等［10］对即食海带腐败微生物进行了分离，认为导致即食海带产品腐败不是由平酸菌引起的，并确定添加增效尼泊金酯钠0.250g/kg可有效延长即食海带产品的保质期，但其并没有继续对腐败微生物的种类进行鉴定。

目前有多种针对芽孢杆菌的鉴定方法，包括形态和生理生化特征鉴定法、抗菌谱实验分类法、化学分类法、分子生物学方法等［12］，其中形态和生理生化特征鉴定是实验室常规菌种鉴定中最常用的方法，VITEK微生物自动分析系统是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一，其原理是以各种生理生化实验为基础，借助现代电脑技术开发的快捷而准确的检测技术，其具有操作简便、检测速度快，还具有联机孵育、定时扫描、误差小、微量安全等特点［13－15］。

表3 菌株生理生化实验结果

本文通过微生物学检验，从腐败的重组海带面产品中分离得到6株菌，经鉴定分别为短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、枝芽孢杆菌(Virgibacillus proomii)、溶 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Paenibacillus amylolyticus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)和缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)。微生物种类的鉴别可以为后续的微生物性质分析、生长控制、杀菌模式等研究奠定理论基础，促进生产和保藏工艺的改进，从而更加有效地指导企业生产，同时也为相似类型产品的保藏提供参考。

［1］樊文乐.海带的综合利用研究［D］.天津科技大学，2006: 1－2.

［2］程玉来，刘瑞娇，边宏.可食性海带纸的研究［J］.食品工业科技，2009，30(2):211－213.

［3］孟秀梅，张绵松，袁文鹏，等.海带食用菌膳食纤维颗粒的制备［J］.食品工业科技，2010，31(12):240－242.

［4］王广峰.海带富锗鲜湿面条的研制［J］.食品科技，2008 (6):124－125.

［5］崔东波.海带牛肉辣椒酱的研制［J］.中国调味品，2011，36 (6):69－71.

［6］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.第三版.北京:高等教育出版社，1996.

［7］潘见，黄训端，谢慧明，等.草莓采后卫生微生物学检查及细菌VITEK鉴定实验［J］.食品科学，2007，28(3):320－323.

［8］曹荣.对虾生物保鲜与其熟制品保藏技术的研究［D］.中国海洋大学，2009:73－74.

［9］乔华林.水产品腐败的形成与控制［J］.肉类研究，1998 (1):17.

［10］刘秀河，渊辛华.延长即食海带保质期的研究［J］.食品研究与开发，2008，29(9):133－137.

［11］唐勇，李洪军.熟食海带软罐头的加工及保鲜［J］.食品工业科技，2000，21(5):59－60.

［12］黄训端，潘见，余晓峰，等.草莓中蜡样芽孢杆菌的VITEK快速检测［J］.微生物学杂志，2006，26(4):99－102.

［13］杨小蓉，罗隆泽，刘红露，等.VITEK 2 compact微生物分析系统快速鉴定猪链球菌2型［M］.预防医学情报杂志，2006，22(1):42－43.

［14］杨毓环，陈伟伟.VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用［M］.海峡预防医学杂志，2000，6(3):38－39.

［15］T Kleiss，P Deberghes，M Durrer，et al.Identification of environmental staphylococci and coliforms by Vitek Auto Microbic System［J］.Food Microbiology，1995，12:199－202.

Purification and identification of spoilage organisms separated from restructured kelp products

WANG Ya－ping1，2，CAO Rong2，JIANG Yan－hua2，LIU Qi2，*，YIN Bang－zhong2，JIANG Qiao1
(1.Food Science and Engineering Department，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China)

In order to prolong the shelf life of novel restructured kelp products，spoilage organisms from restructured kelp noodles were separated，purified and identified by colonial morphology observation，physiology and biochemistry analysis，and VITEK systems identification.Results showed that the 6 strains isolated from the spoiled products were Brevibacillus choshinensis，Virgibacillus proomii，Paenibacillus amylolyticus，Bacillus circulans，Bacillus coagulans and Bacillus lentus.

restructured kelp noodle;spoilage organism;identification

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0251－04

海带(Laminaria japonica)又名昆布，属于褐藻纲海带科，在我国有悠久的食用历史，是一种营养价值极高的海洋植物［1］。海带含有多种对人体健康有益的营养成分，因此其相关产品的开发一直是国内外的研究热点。目前，已开发出一些以海带为原料的保健食品和方便食品，如海带纸、海带食用菌膳食颗粒、海带富锗鲜湿面条、海带牛肉辣椒酱等［2－5］。重组海带面是将海带原料充分破碎，再经浆化、挤压成型、杀菌等工序制作的一种新型方便食品，其日益受到消费者的欢迎。但由于产品含水量高，水分活度大，且生产过程完全暴露于空气中，极易被微生物污染，巴氏杀菌后的产品尽管微生物数量大幅度减少，但仍有部分微生物不能彻底杀灭，因此该类型产品目前需要冷链流通，且保质期较短。为有效地延长重组海带面产品的保质期，本文对腐败的产品进行了微生物的分离纯化及种类鉴定，以期为该类型产品生产和保藏工艺的改进提供理论参考。

2011－08－05 *通讯联系人

王雅萍(1985－)，女，硕士研究生，主要从事水产品加工与贮藏相关研究。

农业部公益性行业科研专项(200903030－A－4)。