杂色鲍组织蛋白酶L的分离纯化与性质研究

董训江，钟 婵，蔡秋凤，曹敏杰

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

杂色鲍组织蛋白酶L的分离纯化与性质研究

董训江，钟 婵，蔡秋凤，曹敏杰*

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

通过硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose阳离子交换层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤和Hydroxyapatite羟基磷灰石层析，从杂色鲍(Haliotis diversicolor)内脏中分离纯化了组织蛋白酶L。SDS-PAGE结果显示，纯化蛋白的分子量约为28ku。该酶最适温度37℃，最适pH5.5。当温度低于40℃，pH在5.0～6.5范围内该酶较稳定。底物特异性实验与抑制剂实验结果表明，该酶属于半胱氨酸蛋白酶。金属离子Mn2+、Ba2+和Mg2+对该酶有不同程度的激活作用，而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等对该酶起抑制作用。

杂色鲍，组织蛋白酶L，分离纯化，性质研究

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杂色鲍 购自福建省厦门市大嶝岛养殖场，平均体重(28.0±2.0)g，新鲜的杂色鲍即杀取其内脏，立即使用或冻存于-80℃待用;SP-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 瑞典 Amersham Biosciences公司;羟基磷灰石预装柱(CHT-ⅡCartridge) Bio-Rad公司;荧光底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Arg-MCA等 日本Peptide Institute公司;反式琥珀酸-亮氨酰胺-胍基丁酮(E-64) Amresco公司;Chymostatin、Leupeptin Roche公司;乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Benzamidine Sigma公司;标准蛋白 Fermentas公司;其它试剂 均为国产分析纯。

Avanti JA-25大型高速冷冻离心机 美国Beckman公司;BioPhotometer紫外分光光度计 德国Eppendorf公司;FP-6200荧光分光光度计 日本Jasco公司;G∶BOX凝胶成像仪装置 美国Syngene公司;组织捣碎机 瑞士Kinematica公司;WB-14恒温水浴锅 德国Memmert公司;蛋白质电泳装置美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活力的测定 以Z-Phe-Arg-MCA为底物，参照Barrett［9］等人的方法，并略作修改：50μL酶液加入900μL含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)(缓冲液A)中，混合均匀后加入50μL 10μmol/L荧光底物，在37℃反应10min，立即加入1.5mL终止液(甲醇∶异丙醇∶水= 35∶30∶35，v/v/v)终止反应，用荧光分光光度计测定反应后释放产物7-amino-4-methylcoumarin(AMC)的荧光强度，测定的激发波长为380nm，发射波长为450nm。

活力单位(U)定义为每min释放1nmol AMC所需要的酶量。

1.2.2 蛋白质浓度测定 纯化过程中，用紫外分光光度计测定在280nm波长下的吸光值转化为蛋白质含量;纯化蛋白的浓度采用Lowry法测定［10］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.2.3 酶的纯化 鲍鱼内脏(约120g)用剪刀剪切成小块，加入冰冷的4倍体积50mmol/L乙酸钠缓冲液(pH4.5)(缓冲液 B)，其中含 1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA，用组织捣碎机充分捣碎，于12000× g离心20min，取4层纱布过滤得上清液进行30%～80%硫酸铵分级沉淀。用少量的缓冲液B溶解沉淀后，在相同外液中透析除盐。

将透析后的酶液上样于事先用含0.2mol/L NaCl的缓冲液B平衡好的SP-Sepharose Fast Flow(2.6× 15cm)离子交换柱，用缓冲液B充分流洗去除未吸附的杂蛋白后，吸附部分的蛋白用含0.2～1.0mol/L NaCl盐浓度的缓冲液B进行线性梯度洗脱，洗脱液的总体积为600mL，洗脱过程中每管收集5mL。对收集到的不同组分进行蛋白质测定和酶活力的检测。收集活性峰部分，用YM-10超滤膜超滤浓缩。

将浓缩后的样品上样于用含有0.2mol/L NaCl的缓冲液B平衡好的Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析柱(1.5×98cm)，然后用相同的缓冲液流洗，每管收集2mL。对收集的不同组分进行A280和酶活力测定。收集活性部分并在5mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)(缓冲液C)中透析，其中含1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA。

将透析后的样品上样于用缓冲液C平衡的羟基磷灰石预装柱(5mL)，充分流洗除去未吸附的杂蛋白。吸附部分的蛋白质用含 1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA的 5～200mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行线性梯度洗脱，洗脱总体积为80mL，洗脱时每管收集1mL。对收集到的不同组分进行蛋白含量和酶活力的检测，同时对活性部分进行SDSPAGE凝胶电泳分析。

1.2.4 分子量的确定和纯度鉴定 分子量测定采用Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)［11］相结合的方法;纯度鉴定通过SDS-PAGE电泳图谱和酶谱分析。

明胶酶谱：凝胶制备同SDS-PAGE凝胶制备，只是分离胶中用0.5mL的明胶溶液替换0.5mL蒸馏水。取一定量纯化的酶液，加入SDS上样缓冲液，直接上样于12%的聚丙烯酰胺凝胶，于4℃下恒流(8mA)电泳。电泳结束后，凝胶移入体积分数为2.5% 的triton X-100中，置于摇床上摇动2×30min以去除SDS。倒掉triton X-100后用蒸馏水洗2～3次，然后将凝胶放入50 mmol/L乙酸钠缓冲液(含1mmol/L EDTA，pH 4.5)中，在37℃恒温水浴中孵育18～24h，取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，倒出考马斯亮蓝染色液后用脱色液缓慢摇动脱色，直至条带清晰为止。

1.2.5 最适温度和温度稳定性 最适温度的测定是将酶液放置在不同温度(0～60℃)下进行酶活力测定，其它测定条件不变。

热稳定性的测定是将酶液加入缓冲液A中，分别在10、20、30、40、50、60℃下放置30min后测定其剩余活性，确定酶的热稳定性。

1.2.6 最适pH和pH稳定性 最适pH测定是将酶液放置在50mmol/L的不同pH缓冲液中进行酶活测定，其它测定条件不变;pH稳定性测定是将酶液放置在50mmol/L的不同pH缓冲液中4℃下孵育4h处理后，用1.2.1的方法在含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的缓冲液A中测定其剩余酶活力。

其中不同pH缓冲液为乙酸钠缓冲液(pH3.0～5.5)和磷酸盐缓冲液(pH6.0～7.0)。

1.2.7 底物特异性测定 以不同类型的荧光底物为目标分解物，酶活测定的其他条件不变，测定相应的酶活力。以Z-Phe-Arg-MCA荧光底物为对照。

1.2.8 蛋白酶抑制剂的作用 在缓冲液A中，将酶液与不同类型的蛋白酶抑制剂充分混合，并在室温下放置30min后，测定酶的剩余活力。对照样品的反应条件一致，但不添加任何抑制剂。

所用抑制剂有：E-64、Leupeptin、Chymostatin、PMSF、Benzamidine、EDTA、EGTA、Pepstatin。

1.2.9 金属离子的作用 在缓冲液A中，将酶液与终浓度为1mmol/L的不同二价金属离子溶液充分混合，室温下放置30min后，测定剩余酶活力。对照样品的反应条件一致，但不添加任何金属离子。

表1 组织蛋白酶L的纯化表

2 结果与分析

2.1 酶的分离纯化

2.1.1 SP-Sepharose阳离子交换柱层析 杂色鲍内脏经过预处理和硫酸铵盐析后，上样于事先用含0.2mol/L NaCl的缓冲液A平衡的SP-Sepharose阳离子交换层析柱，结果如图1所示。由图1可见，SP-Sepharose阳离子交换柱层析可以有效地将杂蛋白与目的蛋白分开。经过酶活力的测定和SDSPAGE电泳图谱分析，收集酶活性高但是杂蛋白相对少的组分(第 218～245管)，经超滤(Amicon，YM-10)浓缩后上样于Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析。

图1 SP-Sepharose阳离子交换柱层析

2.1.2 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析 样品经过Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析的结果如图2所示。由图2可知，除目的蛋白峰外还有其余多个蛋白峰，因此，认为样品经过Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析后与大量杂蛋白分离，有利于目的蛋白的进一步纯化。收集活性峰部分充分透析后，进行下一步羟基磷灰石柱层析。

图2 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析

2.1.3 羟基磷灰石柱层析 如图3所示，样品经过羟基磷灰石柱层析后酶活峰与蛋白峰基本重叠，表明组织蛋白酶L得到了高度纯化。

经过硫酸铵盐析、SP-Sepharose离子交换柱层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱层析和羟基磷灰石柱层析等得到纯度较高的组织蛋白酶L，结果如表1所示。纯化倍数为1582.1，得率为13.4%，酶的比活力为3006U/mg。

图3 羟基磷灰石层析

2.2 组织蛋白酶L的性质分析

2.2.1 分子量的确定和纯度鉴定 SDS-PAGE电泳图谱(图4-A)和明胶酶谱(图4-B)的结果显示，纯化的蛋白酶呈单一条带，表明已达到电泳纯。与标准蛋白相比，其分子量约为28ku。

图4 鲍鱼组织蛋白酶L的纯化结果电泳图注：A：SDS-PAGE;B：明胶酶谱;M：标准蛋白;泳道1：纯化的组织蛋白酶L。

2.2.2 最适温度及温度稳定性 温度对酶活力的影响如图5所示。由图5可知，组织蛋白酶L的最适温度为37℃。在50℃时，组织蛋白酶L表现50%的活性，在10℃和0℃时，分别表现30%和19%的活性，说明该酶在低温下的活性相对较低，但仍具有活性。

图5 组织蛋白酶L的最适温度以及热稳定性

在30℃下放置30min后，酶的活力基本保持不变，而在40℃下放置30min后，酶活下降30%，而50℃下放置30min后，酶活基本丧失，因此，在低于40℃时，该酶的稳定性较好;而当温度高于40℃时，该酶的热稳定性较差。

2.2.3 最适pH及pH稳定性 如图6所示，组织蛋白酶L的最适pH为5.5。pH低于4.0时，组织蛋白酶L的活性在50%以下;而在pH7.0时酶活基本全部丧失。由此可见，组织蛋白酶L是一种弱酸性蛋白酶，其在pH5.0～6.5范围内活性较稳定。

表2 组织蛋白酶L的底物特异性

表3 蛋白酶抑止剂对组织蛋白酶L的作用效果

表4 金属离子对组织蛋白酶L活性的影响

图6 组织蛋白酶L的最适pH及pH稳定性

2.2.4 底物特异性 用不同的荧光底物来研究酶的底物特异性，结果如表2所示，该酶对组织蛋白酶L特异性底物Z-F-R有最强的分解能力，而对组织蛋白酶B的特异性底物Z-R-R、胰蛋白酶底物B-F-S -R、胰凝乳蛋白酶底物S-L-L-V-Y和氨肽酶底物Arg-MCA基本没有分解作用。

2.2.5 蛋白酶抑制剂的作用 各种蛋白酶抑制剂对组织蛋白酶L活性的抑制效果如表3所示。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64在0.01mmol/L时即可完全抑制该酶的活性;胰凝乳蛋白酶抑制剂Chymostatin和丝氨酸半胱氨酸蛋白酶抑制剂Leupeptin对该酶也有强烈的抑制作用;丝氨酸蛋白酶抑制(PMSF、Benzamidine)和天冬氨酸蛋白酶抑制剂(pepstatin)则不能有效地抑制其活性，而金属螯合剂 EDTA和EGTA对组织蛋白酶L活性有一定的激活作用。结果表明，组织蛋白酶L为一种半胱氨酸蛋白酶。

2.2.6 金属离子的作用 由表4可知，在浓度为1mmol/L时，金属离子Mg2+、Ba2+和Mn2+有一定的激活作用，Fe2+和Ca2+能部分抑制酶活性，而Zn2+、Cu2+和Co2+能强烈抑制该酶的活性。

3 讨论

通过一系列柱层析，从杂色鲍内脏中纯化到了组织蛋白酶L。其分子量约为28ku，该结果与从鲤鱼肝胰脏(28ku)［11］、大马哈鱼(30ku)［12］、箭齿鲽肌肉(27ku)［13］中纯化的组织蛋白酶L的分子量相类似，但是与从一些鱼体组织中纯化的高分子量的组织蛋白酶L不同。有些组织蛋白酶L其分子量高达50ku，如日本鲐鱼组织蛋白酶 L的分子量为65～69ku［14］，这种现象可能是组织蛋白酶L与其内源抑制剂结合成酶-抑制剂复合物的结果造成的。

底物特异性及抑制剂实验表明，该酶对组织蛋白酶L底物Z-Phe-Arg-MCA有强烈的分解能力，而对组织蛋白酶B的特异性底物Z-Arg-Arg-MCA几乎不分解，实验结果表明，本研究纯化的是组织蛋白酶L。

从温度特性来看，纯化的杂色鲍内脏组织蛋白酶L最适温度为37℃，在低温下活力较强，但热稳定性较差。这与从其他动物组织中纯化的组织蛋白酶L的最适温度(50～60℃)不同，如鲤鱼肝脏组织蛋白酶L的最适温度为50℃［11］，箭齿鲽肌肉组织蛋白酶L最适温度为60℃［13］。推测可能与鲍鱼的生长环境有关，鲍鱼在水温7℃以下和水温26℃以上几乎不生长，生长最佳温度范围为15～20℃，在正常的栖息水温(10～30℃)下有较强的活性以维持其生理活动。

从pH特性来看，杂色鲍组织蛋白酶L的最适pH为5.5，在pH5.0～6.5之间具有较好的稳定性，是一种弱酸性的酶，这与从其他组织中纯化的组织蛋白酶L具有相似的结果。组织蛋白酶L作为一种溶酶体蛋白酶，具有很重要的生理功能。而这一功能的发挥，需要组织蛋白酶L的前体在溶酶体的酸性条件下自动水解，或在其它蛋白酶作用下水解去掉前体域，形成有活性的成熟的组织蛋白酶。由此可见，这种酶的pH稳定性与这种酶存在的环境所密切相关，对其生理功能的发挥也是很重要的。

组织蛋白酶L是极其重要的溶酶体型半胱氨酸蛋白内肽酶［15］。目前，人们普遍认为组织蛋白酶L对陆生动物的诸多蛋白有很强的水解活性［16］，也是导致鱼糜凝胶劣化的重要酶类。本文对杂色鲍内脏组织蛋白酶L进行了分离纯化，并对其酶学性质进行了初步研究，以期为今后深入研究组织蛋白酶L的生理功能奠定基础，同时为鲍鱼深加工提供一定的理论依据。

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Purification and characterization of cathepsin L from abalone(Haliotis Diversicolor)

DONG Xun-jiang，ZHONG Chan，CAI Qiu-feng，CAO Min-jie*
(College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

Cathepsin L was purified from the hepatopancreas of abalone(Haliotis diversicolor)by ammonium sulfate fractionation，and chromatographies including SP-Sepharose，Sephacryl S-200 gel filtration and hydroxyapatite prepacked column.The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 28ku by SDS-PAGE.Optimum temperature and pH of the purified enzyme were 37℃and 5.5，respectively.The enzyme was stable in the range of pH from 5.0 to 6.5 and at temperature lower than 40℃.Substrate specificity and inhibitor sensitivity analysis revealed that the enzyme was a cysteine proteinase.A survey of effects of metal ions on the enzyme showed that metal ions including Mn2+，Ba2+and Mg2+activated the enzyme to some degree while Co2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+and Ca2+revealed inhibitory effect.

Haliotis diversicolor;cathepsin L;purification;characterization

TS254.1

A

1002-0306(2011)12-0247-05

杂色鲍(Haliotis diversicolor)属于软体动物门，腹足纲，原始腹足目，鲍科，鲍属。其足部肥大、肉质细嫩、营养丰富，具有较高的经济价值和药用价值，是我国南方沿海地区的主要养殖品种［1］。2010年，福建鲍鱼产量突破3万t，其中出口鲍鱼产品约7500t，出口总额超过1亿美元。养殖鲍鱼产量的快速增长，鲍鱼产品的大量出口，不仅为水产养殖户带来利益，也促进了福建省海洋经济的快速发展。鲍鱼在养殖过程中，常遇到病毒、细菌等微生物感染而引起的疾病以及严重时的大量死亡等问题，因此，提高鲍鱼机体的自身免疫力尤为重要。组织蛋白酶L(EC 3.4.22.15)是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成员，广泛存在于动物、植物、细菌和病毒等生物体内，在溶酶体内的蛋白水解过程中起重要作用［2］。组织蛋白酶L作为一种溶酶体蛋白不仅参与生物体内各种蛋白水解过程，还参与许多重要的生命活动［3］，如抗原呈递［4］、寄生虫感染［5］、骨质吸收、主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)降解和细胞凋亡［6-8］等。因此，组织蛋白酶L与鲍鱼的免疫力密切相关。在高等动物中，组织蛋白酶L由于参与机体多种生理、病理过程，备受学者的关注，但在贝类动物中对该酶的研究较少，特别是对鲍鱼组织蛋白酶L的研究尚未见报道。鉴于此，本实验从杂色鲍内脏中分离纯化得到组织蛋白酶L，并研究其酶学性质，以期为探索组织蛋白酶L的生理学功能提供一定的理论依据，同时也可为鲍鱼加工下脚料的回收利用提供新途径。

2011-09-01 *通讯联系人

董训江(1982-)，男，硕士研究生，从事食品生物技术研究。

国家自然科学基金(31071519);福建省自然科学基金(2011J01227)。