褐藻寡糖分子量测定方法的研究

赵 珊，许加超，付晓婷，高 昕

(中国海洋大学食品学院，山东青岛266003)

褐藻寡糖分子量测定方法的研究

赵 珊，许加超*，付晓婷，高 昕

(中国海洋大学食品学院，山东青岛266003)

主要研究了快速、准确的褐藻寡糖分子量测定方法。通过高压降解和氧化降解法制备出褐藻寡糖A和B，分别采用乌式黏度法和高效液相色谱法测定其分子量。结果显示:乌式黏度法测得A和B的分子量分别是7300和5050;高效液相色谱法测得A、B的分子量分别是10666和7935。两种方法测得的分子量趋势关系基本相似，但是分子量数值相差较大。因为乌氏粘度计测量其特性粘度值，不能直接求出绝对平均分子量，是通过经验公式计算所得;而在高效液相色谱法(HPLC)中，以分子量对数(lgMw)对保留时间(t)进行回归处理，得到线性回归方程:lgMw= -2.0338t+25.834，R2=0.9926，回归关系较好。综上所述，HPLC具有效率高，速度快，操作简单，灵敏度高，分辨率高等特点，更适合分子量的测定，为褐藻寡糖分子量的测定提供了有利的科学依据。

褐藻寡糖，分子量，乌式黏度法，高效液相色谱法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

褐藻酸 由青岛黄海制药股份有限公司晶岩生物科技提供;标准系列葡聚糖 中国计量科学研究院，分子量分别为 4320、12600、60600、110000、289000、521000g/mol。

手提式压力蒸汽灭菌锅(YXQG02) 山东新华医疗器械有限公司;高速离心机(TDL-5-A) 上海安亭科学仪器厂;乌氏粘度计 上海申谊玻璃制品有限公司;恒温水槽(温度波动不大于 ±0.05℃); Aglient1100高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;TSK -GelGMPWXL色谱柱 日本Tosoh Bioscience公司。

1.2 实验方法

1.2.1 褐藻寡糖制备 将12g褐藻酸置于锥形瓶，加入150mL蒸馏水(pH约为2.43)，分为2份。A份不作处理，B份加入1%的H2O2。将两份样品分别放入高压灭菌锅中，在121℃高压条件下降解2h。取出后加入2倍体积无水乙醇，沉淀完全后，滴加5mol/L NaOH，不断搅拌调至pH8.5，并维持0.5h以上。将转化好的褐藻寡糖置于离心杯中，5000r/min离心15min。离心后弃去上清液，将沉淀平摊于表面皿上，置于50～60℃干燥箱内4h，得褐藻寡糖A和褐藻寡糖B。

1.2.2 乌氏黏度法测定褐藻寡糖分子量

1.2.2.1 配制待测溶液 分别称取105℃干燥6h的两种褐藻寡糖0.5g，撒于约50mL的0.1mol/L NaCl溶液中(内含0.05%EDTA-2Na)，放置24h后溶解并稀释至l00mL，待测。

1.2.2.2 特性粘数的测定 将上述溶液分别用G3砂型漏斗抽滤，弃去初滤液(约1mL)，取续滤液(不得少于7mL)，按照中国药典乌式粘度法测定特性黏数［η］。

式中：T为待测液的流出时间，s;T＜［0］＞为溶剂的流出时间，s;η＜［r］＞为T/T＜［0］＞，100mL/g; c为供试液的浓度，g/mL［8］。

1.2.2.3 计算分子量 根据Mark-Houwink公式［η］=KMwα，根据文献［11］，取K=2.0×10-5、α=1代入，计算两种褐藻寡糖分子量。

1.2.3 高效液相色谱法测定褐藻寡糖分子量

1.2.3.1 色谱条件［12-13］色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪(HPLC);色谱柱：TSK-gel GM PWxl色谱柱;检测器：示差检测器(RID);流动相：0.2mol/L NaCl(用0.45μm玻璃砂芯过滤装置过滤并脱气);流速：0.5mL/min;柱温：40℃;进样体积：20μL。

1.2.3.2 溶液的制备 将葡聚糖标准品分别溶于流动相中，使其终浓度为1g/L，振摇，室温放置过夜，作为标准品溶液。

1.2.3.3 标准曲线的制备 用0.22μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。记录6种色谱图，以峰位保留时间(t)为横坐标，重均分子量的对数值(lgMw)为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线。

1.2.3.4 褐藻寡糖分子量的测定 将1.2.1制备的两种褐藻寡糖溶于流动相中，使其终浓度为1g/L，振摇，室温放置过夜，在“1.2.3.1”项的色谱条件下，进行HPLC分析，记录峰位保留时间。根据待测样品出峰时间以及标准曲线，计算样品的分子量。

2 结果与讨论

2.1 乌氏黏度法测定褐藻寡糖分子量

乌式黏度法测定的褐藻寡糖分子量结果见表1。

表1 乌式黏度法测定的褐藻寡糖分子量(n=3，t=(25±0.05)℃)

2.2 高效液相色谱法测定褐藻寡糖分子量

2.2.1 标准曲线的制作 将葡聚糖标准品依次进行HPLC分析后发现，图谱均只出现一个吸收峰，峰宽较窄且峰形较好。分子量与保留时间对应关系，如表2所示。以标准品的分子量对数(lgMw)对保留时间(t)进行回归处理，得到线性回归方程：lgMw=-2.0338t+25.834，R2=0.9926，表明回归关系较好，标准曲线如图1所示。

表2 标准品分子量与保留时间的对应表

图1 分子量标准曲线

2.2.2 褐藻寡糖分子量的测定 褐藻寡糖A、B的高效凝胶色谱图，分别如图2和图3所示。

图2表明，褐藻寡糖A的色谱图峰宽较窄且峰形较好，分离效果较好，出峰时间为17.642min。

图3表明，褐藻寡糖B的色谱图峰宽较窄且峰形较好，分离效果较好，出峰时间为17.903min。

根据样品保留时间及标准曲线，求出分子量，结果如表3所示。

图2 褐藻寡糖A色谱图

图3 褐藻寡糖B色谱图

表3 高效液相色谱法测定的褐藻寡糖分子量

结果表明，两种方法测得的分子量趋势关系基本相似，但是分子量数值相差较大，乌式黏度法测得的分子量小于高效液相色谱法测得的分子量。

3 结论

本文通过高压降解和氧化降解的方法制备出褐藻寡糖。分别通过乌式黏度法和高效液相色谱法测定其分子量，结果表明两种方法测得的分子量数量关系基本相似，但是分子量数值相差较大，乌式黏度法测得的分子量小于高效液相色谱法测得的分子量。对于测定方法而言，乌式粘度计实验仪器易得，实验条件简单，操作简便，但仪器的使用和清洗费时费力，而且用乌氏粘度计测量其特性粘度值，不能直接求出绝对平均分子量，而是间接地通过经验公式计算，所以会带来较大的误差;另一种方法，HPLC法具有效率高，速度快，操作简单，灵敏度高，分辨率高，样品用量少，容易回收使用等优点，本文以分子量对数(lgMw)对保留时间(t)进行回归处理，得到线性回归方程：lgMw=-2.0338t+25.834，R2=0.9926，回归关系较好。综上所述，HPLC法更适合在分子量测定方面的广泛应用。本文为褐藻寡糖分子量的测定工作提供了有利的科学依据。

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Study on the determination method of molecular weight of alginate oligosaccharide

ZHAO Shan，XU Jia-chao*，FU Xiao-ting，GAO Xin
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

A rapid and accurate determination method of molecular weight of alginate oligosaccharide was studied. Alginate oligosaccharide A and B were degradated by oxidation and high pressure，and their molecular weight were determined respectively by ubbelohde viscometer and high performance liquid chromatography(HPLC).It was showed that，molecular weights of A and B were just 7300 and 5050，by ubbelohde viscometer，which were 10666 and 7935 however by HPLC.The molecular weights determined by two different methods coincided with each other but varied greatly.It was because that，the molecular weight determined by ubbelohde viscometer was calculated in empirical equation，not the absolute value;however，by HPLC，the linear regression equation was established between the log number of molecular weight(lgMw)and the retention time(t):lgMw=-2.0338t+ 25.834，R2=0.9926，which returned to a good relation.In summary，HPLC was precise，efficiency，smart and simple，which was more suitable for the determination，and provided a theoretical and empirical basis for the molecular weight determination of alginate oligosaccharide.

alginate oligosaccharide; molecular weight; ubbelohde viscometer; high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0486-03

褐藻酸钠是由α-L-甘露糖醛酸(M单元)与β-D-古罗糖醛酸(G单元)的钠盐组成的多糖化合物，是海带等褐藻类植物细胞壁结构多糖。褐藻酸钠的质量要求未见中国药典规定，褐藻酸钠早在1938就已收入美国药典，褐藻酸在1963年收入英国药典。对于褐藻酸钠的质量标准英国准药典(BPO)和日本药局方注解中虽已有规定，也无含量及分子量的规定，分子量的测定虽然不是药典标准所必需，但对于进一步探讨质量也是十分必要的。分子量参数是决定其使用性能的重要因素。褐藻酸钠的分子量大小影响其各种性能，如流变性能、成膜性能、溶解性能等［1-2］。褐藻酸钠属于多糖，是天然高分子中具有多分散性的聚合物，用不同分子量测定方法测定的结果存在很大差异［3-4］。褐藻寡糖可以用很多方法进行制备，包括酸降解法、酶降解法和氧化降解法［5］。采用粘度、沉降平衡、膜渗透、凝胶色谱、光散射等方法测定褐藻酸钠的分子量参数，最常用的决定分子量的方法是在粘性和光散射测定基础上计算而得出的。褐藻酸钠分子量的测定方法之一是乌氏粘度法。将褐藻酸钠溶于一定的溶剂中，用乌氏粘度计测量其特性粘度值，根据特性粘度与分子量之间的关系公式计算出其粘均分子量，但该方法不能直接求出绝对平均分子量，而是间接地通过经验公式计算，所以精确度较差［6］。高效液相色谱法(HPLC)是测定物质分子量的常用方法，该方法既可测定分子量的数值，还可反应分子量的分布情况，在国内外已得到广泛应用［7-10］。但该法需采用标准样品校准，由于市面上很难购得褐藻酸钠分子量标准品，因此关于褐藻酸钠的HPLC测定鲜有报道。本实验通过高压降解和氧化降解法制备出褐藻寡糖，分别采用乌式黏度法和高效液相色谱法测定其分子量，并对测定方法进行研究。

2010-10-14 *通讯联系人

赵珊(1985-)，女，硕士，研究方向:海藻加工与利用。

海洋食品精深加工技术研究与产业化示范(2008BAD94B00)。