腊鱼产香酵母菌的筛选及其发酵产香特性初步研究

梁 慧，马海霞，李来好，*

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部华南水产品加工与质量安全研究中心，广东广州510300;2.上海海洋大学食品学院，上海201306)

腊鱼产香酵母菌的筛选及其发酵产香特性初步研究

梁 慧1，2，马海霞1，李来好1，*

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部华南水产品加工与质量安全研究中心，广东广州510300;2.上海海洋大学食品学院，上海201306)

从传统腊鱼中分离筛选得到了两株产香酵母。结合形态学和酵母菌26S rDNAD1/D2区序列分析，初步鉴定一株为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii，H9)，另一株为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis，J11)。采用固相微萃取(SPME)和气质联用(GC-MS)技术分析两株酵母麦芽汁发酵液的挥发性成分。结果表明，两株酵母的麦芽汁发酵液中的挥发性成分主要为醇类和酯类，但种类和组成差异较大。最后，对两株酵母进行耐盐性、亚硝酸盐耐受性、耐酸性等发酵适应性实验。结果表明，近平滑假丝酵母的发酵适应性强于季也蒙毕赤酵母，有望将其开发成为新型肉品发酵剂。

腊鱼，产香，酵母菌，26S rDNA，发酵特性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腊鱼 湖北荆州自制腊鱼;麦芽汁琼脂培养基、麦芽汁液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基 广东环凯微生物科技有限公司;YEPD液体培养基配方酵母粉 10g，蛋白胨 20g，葡萄糖 20g，蒸馏水1000mL，pH 6.0，115℃湿热灭菌20min;麦氏培养基葡萄糖1.0g，KCl 1.8g，酵母粉2.5g，醋酸钠8.2g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL，121℃湿热灭菌 20min; Biospin真菌基因组提取试剂盒 杭州博日科技有限公司;破壁酶 广州东盛生物科技有限公司;山梨醇缓冲液 广州东盛生物科技有限公司;PCR master mix 2× Fermentas;琼脂糖 西班牙 Biowest;NaCl (分析纯)。

明鉴SPX型智能生化培养箱 宁波江南仪器厂;全自动高压蒸汽灭菌锅 日本YAMATO公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;冷冻离心机Sigma;Eppendorf梯度 PCR仪 德国艾本德公司; Tanon1600型全自动数码凝胶图像处理系统 上海天能科技有限公司;紫外-可见分光光度计Spectronic genesysTM5 赛默飞世尔科技公司;手动SPME进样器、15mL进样瓶、65μmPDMS/DVB纤维萃取头 美国Supleco公司;岛津GC-MS 2010plus日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌分离纯化 无菌条件下称取25g剪碎鱼肉置于225mL生理盐水中，充分振荡，菌悬液经适当稀释后涂布在麦芽汁琼脂平板上，28℃培养3d。选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离纯化，直至得到纯菌株。

1.2.2 产香酵母菌的筛选 将分离纯化得到的菌株分别接入麦芽汁液体培养基中，于28℃摇床培养1d，28℃静置培养2d。感官评定筛选出发酵液产生醇香、酯香的菌株。

1.2.3 酵母菌耐盐性 以2%的接种量将酵母菌接种于氯化钠含量分别为0、2%、4%、6%、8%、10%的YEPD液体培养基中，28℃摇床培养24h，于600nm处测定OD值。

1.2.4 酵母菌亚硝酸盐耐受性 以2%的接种量将酵母菌接种于亚硝酸盐含量分别为0、5、100、150mg/kg的YEPD液体培养基中，28℃摇床培养 24h，于600nm处测定OD值。

1.2.5 酵母菌耐酸性 以2%的接种量接种酵母菌于用乳酸调节pH为4.0、5.0、6.0和7.0的YEPD液体培养基中，28℃摇床培养24h，于600nm处测OD值。

1.2.6 酵母的形态培养特征观察 固体培养特征观察：将分离纯化后的酵母菌株涂布到麦芽汁琼脂培养基平板上，28℃培养72h，观察菌落大小、色泽、表面形态、边缘情况等特征。液体培养特征观察：将分离纯化后的酵母接种于麦芽汁液体培养基中，28℃培养72h后观察有无醭以及有无沉淀物。在油镜下观察酵母的菌体形态及出芽方式，同时观察酵母菌的子囊孢子、掷孢子和假菌丝产生情况［8-9］。

1.2.7 产香酵母菌的鉴定 按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒的方法提取酵母菌的DNA，根据KURTZMAN等［10］的方法扩增分离菌株26S rDNA的D1/D2区域，引物为NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’)，由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系(25μL)：PCR master mix 2× (Fermentas)12.5μL，引物 NL1/NL4(10μmol/L)各1μL，模板DNA 2μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃延伸10min。PCR产物由华大基因测序完成。应用BLAST程序，将所获得的26S rDNAD1/D2区序列与NCBI-GenBank数据库中已知酵母菌相应序列进行同源性分析，以确定菌种归属。

1.2.8 SPME法提取发酵液中的挥发性风味物质取菌株麦芽汁液体培养基发酵液(28℃摇床培养1d，28℃静置培养2d)8mL置于15mL的样品瓶内，加入2g NaCl加盖封口，将样品瓶置于50℃平衡10min，用固相微萃取手柄将探头插入萃取瓶中，退出探头，使探头置于样品瓶的顶空部分(分析前萃取头在GC进样口处250℃解析5min)，于50℃的磁力搅拌器上1000r/min萃取30min，萃取完成后在进样口解析7min［11-12］，用于气相色谱检测酵母菌麦芽汁液体培养基发酵液挥发性风味成分。

1.2.9 菌株发酵液挥发性风味成分GC/MS分析条件 色谱条件：DB-5MS型色谱柱(30m×0.25mm× 0.25μm)。不分流进样;进样口温度250℃;升温程序：35℃，保留 2min，以 1℃/min升到 65℃，再以6℃/min升到220℃，保持3min;载气为高纯氦气，流速为1mL/min。质谱条件：电离方式为EI，电离电压70eV;离子源温度为230℃;扫描范围33～450m/z，扫描方式为scan。

各组分经过计算机NIST05.LIB谱库检索并与相关文献比较，报道匹配度最大的结果，并通过面积归一化法计算挥发性成分的相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 两株产香酵母的培养特征观察

分离得到两株产香酵母菌H9和J11，发酵液的感官香气分别为醇香和酯香，其培养特征如表1所示。

表2 分离酵母菌株26S rDNA序列相似性分析

表1 酵母菌的菌落及菌体形态和液体培养特征

2.2 两株产香酵母分离株的PCR结果

以NL1和NL4为引物对筛选所得的菌株DNA进行酵母菌特异性PCR扩增得到26S rDNA中D1/ D2区域序列，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测片段长度均为600bp左右，且无明显非特异性条带，如图1所示。

图1 酵母H9和J11PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 26S rDNA序列分析

经测定，H9和 J11两株产香酵母菌 26S rDNAD1/D2区序列扩增片段长度分别为595bp和617bp，将两组序列应用 BLAST程序与 NCBIGenBank数据库中的已知酵母菌序列进行相似性比较分析，结果发现，菌株H9的26S rDNAD1/D2区序列与 GenBank数据库中 Meyerozyma guilliermondii (Pichia guilliermondiiATCC 6260)登 录 号 为AAFM01000051的序列相比，仅有2bp的差异，同源性达到99.66%;菌株 J11与Gen-Bank数据库中Candida parapsilosis CDC317 登 录 号 为CABE01000013的序列相比，除多了3个核苷酸，还有10bp的差异，同源性为98.37%，鉴定结果如表2所示。

2.4 产香酵母发酵液挥发性风味成分分析

H9和J11两株产香酵母发酵液的挥发性成分气相色谱图如图2、图3所示，各组分质谱经计算机NIST05.LIB谱库检索及相关资料分析，用峰面积归一化法，计算各组分相对百分含量，并分析各组分的气味，将挥发性成分按照保留时间先后顺序统计，见表3。

图2 酵母H9麦芽汁发酵液挥发性成分总离子流色谱图

图3 酵母J11麦芽汁发酵液挥发性成分总离子流色谱图

从表3可以看出，酵母J11比酵母H9出峰率高，产生的挥发性成分较多，酵母H9麦芽汁发酵液共分离出11种挥发性风味成分，酵母J11麦芽汁发酵液共分离出17种挥发性成分，两株产香酵母的麦芽汁发酵液挥发性成分主要是醇类和酯类，但醇和酯的含量以及组成各异。酵母H9麦芽汁发酵液的主体风味物质是醇类，异戊醇和苯乙醇的相对百分含量分别达到57.39%和23.20%，和酵母J11发酵液相比酯类的种类相对较少，这与感官评定其发酵液的主体香味为醇香一致，同时酵母H9发酵液中产生一种特有的具有香辛料、丁香和发酵似香气和炒花生气息的酚类挥发性成分4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。酵母J11的挥发性成分中含有大量不同的酯类，且大多数具有令人愉悦的香气，因而赋予该菌株发酵液浓郁的酯香。有研究表明，酵母是具有很大产油潜力的微生物［13］，高媛［14］等也筛选到高产油的假丝酵母。该研究发现酵母J11发酵液中存在大量的高级脂肪酸酯类，包括饱和脂肪酸酯(十二酸乙酯、十四酸乙酯和十六酸乙酯等)和不饱和脂肪酸酯(3，6-十二碳二烯酸甲酯、反式-4-癸烯酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯等)，由此可以推测，酵母J11可能是一株产油脂的酵母菌，其细胞裂解后将代谢产生的脂肪酸释放到发酵液中，并与发酵液中的低级醇形成脂肪酸酯。

2.5 两株产香酵母的发酵特性实验

2.5.1 耐盐性 食盐是肉制品加工中必不可少的添加调味料，添加量一般在2%～6%左右，适宜于发酵肉制品的菌株必须有良好的食盐耐受性，一般要求能够在至少6%食盐浓度下能够正常生长［15］。由图4可以看出，当食盐添加量小于4%时，酵母H9和J11的生长状况良好，但当食盐的添加量超过4%时，随着食盐添加量的增加，两株酵母的生长开始受到不同程度的抑制，其中食盐对酵母H9的抑制作用非常明显。当食盐添加量达到8%～10%时，酵母H9生长几乎停滞，而酵母J11的生长略有下降。酵母J11的耐盐性要明显好于酵母H9。

表3 菌株H9、J11麦芽汁发酵液挥发性成分相对峰面积及气味

图4 不同食盐含量对酵母H9和J11生长的影响

2.5.2 亚硝酸盐耐受性 在肉制品的加工中通常通过添加NaNO2对肉制品进行发色，并且NaNO2还有抑制腐败菌的作用。国家标准规定腌腊肉制品中的亚硝酸盐的最大使用量为150mg/kg［16］，因此要求用于肉制品发酵的菌种应具有较好的亚硝酸盐耐受性，一般要求菌种至少能耐受100mg/kg的亚硝酸盐。由图5可知，NaNO2添加量在0～150mg/kg范围内，酵母H9和J11的生长均几乎不受亚硝酸盐添加量的影响，具有很好的亚硝酸盐耐受性。

图5 不同亚硝酸盐含量对酵母H9和J11生长的影响

2.5.3 耐酸性 酵母菌通常与乳酸菌复配应用于肉制品发酵，很少单独使用，因此，酵母菌必须能够适应乳酸菌所造成的酸性环境［17］。从图6可以看出，酵母菌H9和J11在pH4.0～7.0范围内均生长良好，但pH为4.0时，酵母H9的生长受到了些许抑制，但仍能正常生长。

3 结论

从湖北腊鱼中分离筛选得到H9和J11两株产香酵母，分别初步鉴定为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)和 近 平 滑 假 丝 酵 母 (Candida parapsilosis)。其中，酵母H9(Pichia guilliermondii)麦芽汁液体培养基的主体挥发性风味物质为醇类，还产生一种特有的呈香辛料、丁香和发酵似香气和炒花生气息的4-乙烯基-2-甲氧基苯酚;酵母 J11 (Candida parapsilosis)的麦芽汁液体培养基发酵液酯香浓郁，产酯更为丰富，能产生多种高级脂肪酸酯，这可能与其脂肪酸代谢有关。另外，酵母J11与酵母H9相比具有更优良的耐盐性、亚硝酸盐耐受性、耐酸性等发酵特性。因此，酵母J11有望开发为新型的肉品发酵剂，酵母H9的耐盐性较差，有待进一步的驯化和研究。

图6 不同pH对酵母H9和J11生长的影响

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Screening of aroma-producing yeast strains from dry-cured fish and initial study on their aroma-production and fermentation characteristics

LIANG Hui1，2，MA Hai-xia1，LI Lai-hao1，*
(1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，South China Research Center for Aquatic Product Processing and Quality Safety，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China; 2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Two yeast strains were isolated from dry-cured fish，and initially identified as Pichia guilliermondii(H9) and Candida parapsilosis(J11)by morphological characteristics and 26S rDNAD1/D2 domain sequence analysis. Volatile compounds from malt wort fermentation broth of yeast H9 and J11 were analyzed by headspace solidphase micro extraction(SPME)coupled to gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Results showed that volatile compounds from malt wort fermentation broth of two species yeast strains were mainly alcohols and esters，but of great difference in kind and composition.Finally，Candida parapsilosis was considered to have the potential to be developed as a new starter culture for meat because of its better fermentation adaptability such as salt tolerance，nitrite tolerance and acid resistance.

dry-cured fish;aroma production;yeast;26S rDNA;fermentation characteristics

TS254.1

A

1002-0306(2011)12-0213-05

产香酵母，是一类能产生香味物质的酵母菌，目前主要分离筛选产香酵母并将其应用于白酒、葡萄酒、果汁、酱油、香精香料中［1］。产香酵母在代谢过程中主要产生醇类和酯类等香味物质，从而赋予食品特有的香气［2］。微生物作用下醇类和酸类的酯化反应产生具有各种芳香气味的酯类，对提高产品的风味品质有重要作用。目前，酵母菌对发酵肉制品风味的形成特点尚未有定论［3］。Olesen等［4］发现产朊假丝酵母(Candida utilis)能产生多种挥发性成分，特别是酯类和醇类，而汉逊氏德巴利酵母对挥发性成分的形成几乎没有作用;而另一些研究则表明德巴利酵母影响蛋白质水解和挥发性成分产生，适量的德巴利酵母可以通过抑制脂肪氧化和促进乙酯类的形成来影响挥发性产物，但德巴利酵母过量将会产生大量的酸对风味产生负面影响［5-6］。目前，已有很多关于肉制品中优势细菌(乳酸菌、葡萄球菌和微球菌等)筛选及应用的研究，国外也早已将酵母菌应用于发酵肉制品的生产中，常选用的是汉逊氏德巴利酵母(Dabaryomyces hansenii)和法玛塔假丝酵母(Candida famata)，但直接从传统肉制品中筛选优势自然酵母菌株的研究甚少。国内传统肉制品(如火腿、香肠、腊鱼、腊肉等)中广泛存在着优良的自然菌株，是分离筛选优良野生菌株的重要来源。该研究从传统腊鱼中筛选产香酵母菌，结合酵母菌的培养形态及26S rDNAD1/D2区序列分析进行快速分类鉴定［7］，并研究其产香特性及其耐盐性、亚硝酸盐耐受性和耐酸性等相关发酵特性，旨在分离得到能够应用于肉制品加工的产香酵母，为开发新的肉制品发酵剂提供一定的理论基础。

2011-08-26 *通讯联系人

梁慧(1986-)，女，硕士研究生，从事水产品加工与质量安全研究。

国家现代农业产业技术体系(CARS-49);国家农业科技成果转化资金项目(2010GB23260577，2009GB2E200303，2010GB2E000335); 广 东 省 科 技 计 划 项 目(2009A020700004，2008A020100006;2009B020201003);广东省海洋渔业科技推广项目(A200899B02，A200901C01);农业部中央级公益性科研院所基本科研项目(2010YD07)。