硫酸软骨素的降解及其降解产物抗氧化活性的测定

张 莲，王金鹏，孔子青，陈晓明，徐学明，金征宇

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122)

硫酸软骨素的降解及其降解产物抗氧化活性的测定

张 莲，王金鹏，孔子青*，陈晓明，徐学明，金征宇*

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122)

对高分子硫酸软骨素分别进行酸解及酶解，得到相同分子质量范围的硫酸软骨素低聚糖。从聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子质量、紫外吸收图谱、硫酸基含量等方面对降解产物进行了表征，并检测了产物的DPPH自由基的清除能力及还原能力。结果表明，在控制条件下两种降解方法得到的硫酸软骨素低聚糖的重均分子量为5300～3500u，且组分基本相同;紫外分析表明，酸解得到的硫酸软骨素低聚糖含有不饱和糖醛酸，具有部分双键;与酶解产物相比，酸解产物的DPPH自由基的清除能力及还原能力较强。

硫酸软骨素寡糖，降解，抗氧化活性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

硫酸软骨素 食品级，陕西森弗生物科技有限公司;透明质酸酶 HAase，牛睾丸，EC 3.2.1.35; sigma公司，Type I－S，437U/mg;其余试剂 均为分析纯。

Waters 600高效液相色谱仪 配2410示差折光检测器和Empower工作站;V－1800可见分光光度计 上海光谱达仪器有限公司;DKZ恒温振荡水浴槽 上海一恒科技有限公司;BIO－RAD powerpac电泳仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 酶法降解制备硫酸软骨素寡糖 将0.2g硫酸软骨素溶解于10mL pH5.9的磷酸盐缓冲液中，置于37℃保温10min，使其与反应温度达到一致，尔后向底物溶液中加入一定量的HAase，使其酶活为1.4× 105u/L，振荡反应22h。反应结束后，加热煮沸20min使酶失活，4000r/min离心15min，取上清液加3倍体积95%乙醇沉淀，静置，乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素低聚糖A。

1.2.2 酸法降解制备硫酸软骨素寡糖 将0.35g硫酸软骨素溶解于10mL 0.4mol/L盐酸溶液中，置于65℃恒温振荡水浴锅中，控制反应24h，反应结束后用0.4mol/L NaOH溶液中和至中性。3倍体积95%乙醇沉淀，静置，乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素低聚糖B。

1.2.3 分子质量的测定 采用高效凝胶过滤色谱(HPGFC)法测定。色谱柱:UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2;流动相:0.1mol/L NaNO3;流速:0.9mL/min;柱温:45℃;检测器:2410示差折光检测器。

1.2.4 天然PAGE分析 电泳条件:浓缩胶浓度5%，分离胶浓度35%;室温，200V，1.5h。染色条件: 0.5%甲苯胺蓝溶于2%乙酸溶液中，染色1h。脱色: 2%乙酸脱色。

1.2.5 紫外吸收分析 将硫酸软骨素低聚糖A、B用去离子水充分溶解，室温下，用紫外可见分光光度计在190～400nm范围内进行扫描，以去离子水作为空白进行基线调零。

1.2.6 硫酸基含量的测定 硫酸基含量采用硫酸钡比浊法测定［11］。

称取硫酸软骨素低聚糖 A、B各50mg，置于25mL容量瓶中，加入 1mol/L HCl溶液 5mL，于100℃水浴中水解2h，冷却后，加盐酸溶液补至刻度线，滤纸过滤，除去不溶物质。

分别吸取样品液0.2mL，加入三氯乙酸溶液3.8mL及氯化钡溶液 1.0mL，摇匀，室温下静置15min，360nm测吸收度A1;以1.0mL明胶溶液代替氯化钡溶液，测吸收度A2。以0.2mL 1mol/L HCl溶液作空白。

1.2.7 抗氧化能力的测定

1.2.7.1 对DPPH·的清除 DPPH·清除能力根据文献［12］测定并稍做改进。200μL 40 mg/mL的硫酸软骨素低聚糖 A、B溶液，加入 800μL 0.004% (w/v)DPPH·无水乙醇溶液。室温振荡30min，517nm处测定吸光度。以抗坏血酸作对照。

式中:AC:除样品外包含所有试剂的吸光度;AS:样品吸光度。

1.2.7.2 还原能力的测定 还原能力根据文献［12］测定。向1mL 40mg/mL的硫酸软骨素低聚糖A、B溶液加入2.5mL 200mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.6)及2.5mL 1%的硫氰化钾溶液。50℃振荡20min后加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液。5000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL去离子水及0.5mL 0.1%氯化铁溶液，700 nm测吸光度。以抗坏血酸作对照。

2 结果与讨论

2.1 硫酸软骨素的降解

美国专利局USP 3，405，120已证明，分子质量在5300～3500u时，硫酸软骨素的药理活性最强，对防治动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合等具有更好的疗效［9］，故本实验降解目标分子质量范围为5300～3500u。PAGE分析表明，在酶解和酸解作用下，高分子CS已发生降解，且两种方法所得降解产物的组分基本相同(见图1)。经HPGFC测定，CS原料的重均分子质量(Mw)为65142u，经酸降解后为5020u，经酶降解后为4796u(见表1)。与CS相比，降解后的CS寡糖分子质量分散指数(Mw/Mn)有所降低，并且酶解得到的产物分子质量分散指数比酸解产物更低，表明酶解产物的分子质量分布范围较窄。此外，酶解后低分子质量硫酸软骨素颜色为乳白色，与高分子质量硫酸软骨素原料颜色相近，而酸解后颜色为橘红色，这种颜色的变化可能会限制酸解低分子质量硫酸软骨素在美容或某些特定食品中的应用。

图1 硫酸软骨素及其降解产物的PAGE分析

表1 硫酸软骨素及其降解产物的分子质量特征

2.2 紫外吸收光谱分析

硫酸软骨素低聚糖 A、B的紫外吸收图谱见图2。由图2中可以看出，两个吸收图谱的形状较为接近，在210nm左右均具有很强吸收峰。分析表明，210nm为羰基的特征吸收峰;280nm左右吸收峰很小，说明几乎不含蛋白质、核酸等成分;CS低聚糖A在235nm处无明显特征吸收峰，说明用牛睾丸透明质酸酶降解CS所得产物为饱和寡糖，这与Kennita L.Jobe［6］的报道相吻合;CS低聚糖B在230～240nm处吸收峰变宽，这可能是由于生成了4，5－不饱和糖醛酸等不饱和结构［13－14］。

表2 硫酸软骨素及其降解产物硫酸基含量及抗氧化活性

图2 低分子质量硫酸软骨素UV图谱

2.3 抗氧化能力的测定

2.3.1 对DPPH·的清除作用 表2显示了降解产物对DPPH·的清除作用。从表2可以看出，酸解产物对DPPH·的清除作用高于酶解产物。硫酸软骨素作为糖胺聚糖的一种，其结构中硫酸基的数量和连接位置使其表现出不同的生物活性［2］，不饱和结构的有无也使其具有不同的抗炎活性［6］，这可能也是其抗氧化活性的重要因素。目前，尚未有人对硫酸软骨素低聚糖的抗氧化活性与其结构及硫酸基含量之间的关系做过研究报道。通过对两种降解产物硫酸基含量的测定可知，酶解和酸解后CS低聚糖A、B硫酸基含量分别为11.83%和8.98%，与高分子硫酸软骨素相比硫酸基含量有所降低(12.95%)，酸解造成了硫酸基更多的脱除，具体结果见表2。我们认为，一方面，硫酸基含量的降低可能会造成对DPPH·清除能力的下降，这在酸解所得卡拉胶低聚糖的抗氧化活性中亦得到了体现［10］。另一方面，酸解过程中双键的形成可能提高了CS低聚糖B对DPPH·的清除能力。Jamal Alyoussef Alkrad［15］等人也曾报道，透明质酸糖胺聚糖在降解过程中形成的双键对自由基毒性的降低起到了至关重要的作用。具有较低硫酸基含量的CS低聚糖B，其DPPH·清除能力较强，推测CS低聚糖B中的不饱和双键对DPPH·清除能力至关重要，硫酸基含量和DPPH·清除能力之间并无显著联系。

2.3.2 还原能力的测定 还原能力主要与氢离子的供应有关。物质的还原能力是揭示其抗氧化活性的一个重要的指标。化合物的抗氧化活性与许多机制有关，例如阻止反应链的引发，阻止过渡金属离子的催化，过氧化氢的分解等。硫酸软骨素的还原能力机制可能与其结构中羰基的存在有关［16］，其上带电基团可能也与过渡金属离子如Cu2+或Fe2+等发生作用。酸解CS低聚糖B较酶解CS低聚糖A具有更高的还原能力，这可能同样是与酸解过程中双键的形成有关(见图3)。

3 结论

采用酸解和酶解两种方法制备了相同分子质量范围的硫酸软骨素低聚糖，所得降解产物结构不同，造成了其抗氧化能力的不同。酸解得到的硫酸软骨素低聚糖具有更好的DPPH·清除能力以及还原能力，这可能与酸解过程中双键的形成有关，推测硫酸软骨素寡糖中不饱和糖醛酸结构的生成对DPPH·清除能力以及还原能力的提高起到了至关重要的作用，而硫酸基的含量对其无明显影响。

图3 硫酸软骨素低聚糖的还原能力

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Degradation of chondroitin sulfate and antioxidation of its degraded products

ZHANG Lian，WANG Jin－peng，KONG Zi－qing*，CHEN Xiao－ming，XU Xue－ming，JIN Zheng－yu*
(State Key Laboratory of Food Science＆Technology，School of Food Science and Technology，Southern Yangtze University，Wuxi 214122，China)

Two chondroitin sulfates oligosaccharides in the same weight were prepared by HAase degradation and acid degradation.The structures were characterized by PAGE，molecular weight，UV and sulfate content，and the scavenging effects on 1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl and reducing powers of chondroitin sulfate oligosaccharides were investigated.Under controlled conditions，the chondroitin sulfate oligosaccharides had same compositions，and their number average molecular weights were about 5300～3500u.Some double bonds were produced in the chondroitin sulfate oligosaccharides of acid degradation from the UV absorption spectra，and the antioxidant activity and DPPH radicals were higher than the oligosaccharides by HAase degradation.

chondroitin sulfate oligosaccharides;degradation;antioxidant activity

TS201.2+3

A

1002－0306(2011)12－0180－04

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)由D－葡糖醛酸与N－乙酰－D－氨基半乳糖酸硫酸酯组成，是一类广泛存在于人类和动物的喉骨、鼻中隔、气管等软骨组织中的酸性黏多糖［1］，属于糖胺聚糖的一种。高分子质量的CS具有较高的生物活性，在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用［2］，目前在医药及临床中已有所应用［1］。但是由于细胞膜的选择透过性等因素，临床应用中大部分糖胺聚糖主要面临生物利用率较低的问题［3］。最近几年，低分子质量CS的功能特性越来越受到人们的重视［4－6］，但国内对CS的研究主要集中于其提取、生理活性及衍生物等方面，对CS寡糖的研究未见报道。目前，CS低聚糖主要由酶［4］和酸［7－9］等降解而得。酶解法因条件温和、专一性强，是目前最常用的降解硫酸软骨素的方法，但是不同来源的酶对硫酸软骨素的酶解机理不同，导致所得到的CS寡糖的结构及功能略有不同，例如由哺乳动物酶产生的CS低聚糖为饱和寡糖，可能具有促炎作用，而由细菌酶产生的低聚糖含有不饱和糖醛酸，具有部分双键，可能没有促炎作用或具有抗炎作用［6］。酸降解相对剧烈，可能会引起部分硫酸基的水解，导致体外自由基清除能力的降低［10］。本文采用了酶解和酸解两种手段对硫酸软骨素进行了降解，对两种方法降解得到的硫酸软骨素低聚糖的特性进行了比较，并研究了其抗氧化活性，以期为硫酸软骨素降解方法的选择提供一定的依据，并为硫酸软骨素寡糖的制备及其抗氧化活性的研究提供一定参考。

2010－12－20 *通讯联系人

张莲(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:碳水化合物资源。

国家自然科学基金(20976070)。