琯溪蜜柚皮乙醇提取物的抑菌及防腐效果

郑艺梅，许开城，陈芸芸

(1.漳州师范学院生物科学与技术系，福建漳州363000; 2.漳台休闲食品技术创新中心，福建漳州363000)

琯溪蜜柚皮乙醇提取物的抑菌及防腐效果

郑艺梅1，2，许开城1，陈芸芸1，2

(1.漳州师范学院生物科学与技术系，福建漳州363000; 2.漳台休闲食品技术创新中心，福建漳州363000)

以乙醇作提取剂，制备琯溪蜜柚皮提取物，探讨其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和黑曲霉的抑菌效果。滤纸片扩散法测定蜜柚皮醇提物的抑菌活性，固体稀释法测定蜜柚皮醇提物的最小抑菌浓度，研究了温度、pH对蜜柚皮醇提物抑菌效果的影响，并进行了果蔬的防腐保鲜初步实验。结果表明，蜜柚皮醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母具有较强的抑菌效果，其最低抑菌浓度分别为6.25%、12.5%和12.5%;对大肠杆菌和黑曲霉没有明显的抑菌效果。蜜柚皮醇提物的抑菌效果受温度影响较小，受pH影响较大，酸性环境下抑制作用较强。蜜柚皮醇提物具有良好抑菌和防腐保鲜效果，可作为天然食品防腐剂进行开发和利用。

蜜柚皮，乙醇提取物，抑菌效果，防腐效果

食品的腐败变质主要由微生物引起，传统的化学防腐通常会掩盖或破坏食品的营养和自然风味等，而且还涉及到安全性问题。研发天然食品防腐剂已成为食品科学领域研究的热点。琯溪蜜柚是分布于福建省漳州市平和县的特有柚子品种，种植面积达4万hm2，年产量达60万t，约占全国柚类总产量的25%［1］。在鲜食或加工中，占果实总量约45%的蜜柚皮作为废弃物丢弃，造成了环境污染和资源的浪费。研究表明，柚皮含有多种生理活性成分［2］，其提取物的抑菌［3－5］和抗氧化［6－8］作用因柚子品种、提取剂等不同而有差异;柚皮提取物用于果蔬防腐保鲜很少［9］，而琯溪蜜柚皮乙醇提取物的抑菌效果及其影响因素、对果蔬的防腐效果方面未见报道。本实验研究琯溪蜜柚皮乙醇提取物对常见细菌、霉菌和酵母菌的抑制效果及其影响因素，并进行果蔬的防腐保鲜初步实验，探讨其实际防腐效果，以期为天然食品防腐剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜琯溪蜜柚 采自平和县，蜜柚洗净擦干，取外皮烘干、粉碎后备用;供试菌种 细菌－金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);霉菌－黑曲霉(Aspergillus niger);酵母菌－啤酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)，以上菌种均由本系微生物实验室提供;无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、蔗糖、盐酸等 分析纯试剂;胰化蛋白胨，琼脂粉，酵母浸膏，102型新华滤纸。

RE52－99旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂; TGL－20M台式高速速冻离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司;PYX－250G－B光照培养箱 广东韶关科力实验仪器有限公司;GZX－9140ME数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂; HH－2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市江南仪器厂;洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;LDZX－50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂; HK－02A手提式粉碎机 广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 蜜柚皮醇提物的制备

取300g粉碎后的蜜柚皮置于烧杯中，按料液比1∶10加入70%的乙醇溶液，置于电炉上，80℃下提取3次，每次30min，合并滤液，8000r/min离心10min，取上清液，再在旋转蒸发器浓缩，得到1∶1的浓缩液备用。1∶1浓缩液定义为1mL提取液中含有1g蜜柚皮粉原料。

1.3 培养基的制备［10］

1.3.1 LB培养基 取胰化蛋白胨10.0g、酵母浸膏5.0g、氯化钠10.0g、琼脂粉20g、水1000mL，加热溶化，调pH 7.4～7.6，高压湿热灭菌(121℃，20min)，备用。

1.3.2 豆芽培养基 取豆芽100g和水1000mL放入烧杯煮沸30min，纱布过滤，去离子水补足原量，再加入蔗糖50g和琼脂粉20g，加热溶化，pH为自然状态，分装，高压湿热灭菌(121℃，20min)，备用。

1.4 供试菌液制备［11］

1.4.1 细菌菌悬液和酵母菌菌悬液的制备 细菌用LB培养基，酵母菌用豆芽培养基。将供试菌种分别接种到装有对应培养基的试管内进行扩大培养。细菌在37℃培养24h，酵母菌在28℃培养24h。取活化好的菌种斜面，用无菌水配制成(1～10)× 106CFU/mL的菌悬液，备用。

1.4.2 霉菌孢子悬液的制备 将供试菌种分别斜面接种到豆芽培养基中，在28℃培养72h，取活化好的菌种斜面，用无菌水配制成(1～10)×106CFU/mL的霉菌孢子菌悬液，备用。

1.5 抑菌实验

1.5.1 滤纸片法测定抑菌活性［12］将吸水性强的滤纸用打孔器打成直径6mm的圆形小纸片，分装于洁净干燥的培养皿中，干热灭菌(160℃，2h)后，备用。用无菌镊子将滤纸片放入无菌水和70%的乙醇提取物(1∶1浓缩液)中作空白对照实验，均浸泡30min，取出后沥去多余的试液晾干。取制备好的菌悬液0.5mL，滴入已经倒有相应固体培养基的平皿表面，用涂布器使其均匀分布在培养基的表面。用无菌镊子夹取浸有上述2种液体的滤纸片，放入含菌平皿中，每皿无菌水的放1片、醇提物的放3片。然后将各平皿放入每种菌适宜的温度培养箱内培养(细菌37℃，培养24h;酵母菌、霉菌28℃，培养48h)。每种菌种做2皿重复实验，取抑菌圈直径平均值。

1.5.2 最低抑菌浓度的测定［13］醇提物进行二倍稀释。将醇提物溶液换成 50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782mg/mL，在各平皿倒入10～15mL醇提物进行二倍稀释已溶化的固体培养基，混匀、冷却、凝固后，每皿加入0.5mL菌悬液，涂匀，在相应的温度下培养一定时间(同上)，观察每皿生长情况。每个浓度做2个重复实验。

1.5.3 耐热性的测定 取蜜柚皮醇提物，用4支小试管每支分装3mL，用无菌镊子将滤纸放进各试管中，1支于常温下放置，另外3支分别置60、80、100℃下处理30min，取出按1.5.1量取抑菌圈直径，以常温处理的作空白对照。

1.5.4 抑菌 pH范围的测定［14］用 NaOH溶液和HCl溶液调节蜜柚皮醇提物的pH分别为4、4.68、5、6、7、8、9，按1.5.1量取抑菌圈直径，以未处理的蜜柚皮醇提物作空白对照。

2 结果与分析

2.1 蜜柚皮醇提物抑菌效果

蜜柚皮提取物抑菌效果如表1所示。

表1 蜜柚皮醇提物抑菌效果

滤纸片法测定结果(表1)显示，蜜柚皮醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母有较强的抑菌作用，对大肠杆菌和黑曲霉未显示抑制作用。对供试菌的抑制作用相对强弱次序为:金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母＞枯草芽孢杆菌。

李春美等［5］实验发现，葡萄柚柚皮60%的乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉具有较强的抑制作用。蒋玲艳等［4］研究表明，沙田柚柚皮95%的乙醇提取物对枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及酵母菌的抑制相对较弱，对黑曲霉没有明显的抑菌效果。戴玉锦等［7］用70%乙醇及无水乙醇制备的高黄酮含量蜜柚皮提取物，对大肠杆菌抑制作用明显，而对黑曲霉抑制作用不明显。

本实验与以上研究结果相比较，柚皮醇提物对相同微生物的抑菌作用相似或不同，分析其原因可能是柚子品种不同、提取剂乙醇浓度不同等影响的。

表5 蜜柚皮醇提取物的防腐效果

基于表1显示的抑菌效果，以金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌为供试菌，确定蜜柚皮醇提取物的最小抑菌浓度，进而研究温度、pH对蜜柚皮醇提物抑菌作用效果的影响。

2.2 蜜柚皮醇提物最低抑菌浓度

蜜柚皮醇提物最低抑菌浓度见表2。

表2 蜜柚皮醇提物最低抑菌浓度

从表2可以看出，随着醇提物浓度的增大，抑菌能力也逐渐增强;蜜柚皮醇提物对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的最低抑菌浓度最小都是12.5%，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度最小为6.25%。李春美等［5］研究结果表明葡萄柚皮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度最小均为2.5%，实验结果不同的原因同2.1的分析。

2.3 温度对蜜柚皮醇提物抑菌效果的影响

醇提物分别在60、80、100℃和常温下处理30min后，测得其抑菌圈直径如表3所示。

表3 温度对蜜柚皮醇提物抑菌效果的影响(mm)

由表3可以看出，对同一种微生物，不同温度处理后醇提物的抑菌圈直径大小相近，表明蜜柚皮醇提取物的抑菌作用受温度影响不大。这与文献［4］和［5］的报道不一致，这可能与处理的方法、柚皮中抑菌成分及其耐热性不同有关。

2.4 pH对蜜柚皮醇提物抑菌作用的影响

pH对蜜柚皮醇提物抑菌作用的影响见表4。

表4 pH对蜜柚皮醇提物抑菌效果的影响(mm)

从表4可知，蜜柚皮醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌的抑菌作用随pH的升高而减弱。蜜柚皮醇提取物本身呈酸性，其溶液自然pH为4.68，酸性pH下抑菌效果较好，在中性环境下，醇提物对金黄色葡萄球菌和啤酒酵母仍有抑菌作用，抑菌次序是金黄色葡萄球菌＞啤酒酵母，但对枯草芽孢杆菌没有抑菌效果，碱性环境下均无抑菌效果。说明蜜柚皮醇提物在偏酸pH下抑菌效果更强。这与文献［5］的结果一致。

2.5 防腐保鲜效果

选取新鲜的蘑菇、葡萄和圣女果，洗净、沥干后放入醇提物(1∶1)中浸泡30min，取出晾干，分装于经过灭菌的培养皿中，置于30℃培养8d。肉眼观察以上果蔬感官变化，用无菌水作空白对照实验，结果见表5。

从表5可以看出，经过醇提物处理的果蔬在贮藏期间，其感官性状明显优于未经处理的。实验第4d时未处理的葡萄已经有失水现象，而经过醇提物处理的葡萄还保持一定的硬度。第8d时未处理的葡萄出现软腐，颜色变为黑紫色，而经过醇提物处理的葡萄仅变软，颜色为深紫红。未处理的圣女果第4d表皮出现微皱缩，而经过醇提物处理的保持一定的硬度，第8d时圣女果已经变软，汁液有渗出，而经过醇提物处理的只稍萎，但硬度依然保持。蘑菇在贮藏过程中外观形态变化很大。观察实验第4d时，未处理的蘑菇已经汁液渗出，严重发霉、发臭，而经过醇提物处理的蘑菇汁液有点渗出，菇面比较亮，说明蜜柚皮醇提物具有良好的防腐效果。

3 结论

蜜柚皮醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母有较强的抑菌效果，对大肠杆菌和黑曲霉没有抑菌效果。对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为6.25%，对枯草芽孢杆菌和酵母菌的最低抑菌浓度均为12.5%。蜜柚皮醇提物的抑菌作用受温度影响不大，但受pH的影响较大，酸性环境下抑制作用较强。蜜柚皮醇提取物具有良好抑菌和防腐保鲜效果，可作为天然食品防腐剂进行开发和利用。

［1］陈华俐.深加工让琯溪蜜柚价增八倍［N］.福建日报，2010－01－05.

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Study on antimicrobial and preservation effect of the ethanol extract from honey pomelo peel

ZHENG Yi－mei1，2，XU Kai－cheng1，CHEN Yun－yun1，2
(1.Department of Biological Science and Technology，Zhangzhou Normal University，Zhangzhou 363000，China; 2.Technological Innovation Center of Zhangzhou and Taiwan Leisure Foods，Zhangzhou 363000，China)

The ethanol extract was prepared from honey pomelo peel，and its antimicrobial effect on Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger were studied.The filter paper diffusion method and solid dilution method were used to determine the antimicrobial activity and the minimal inhibitory concentration(MIC)，respectively.The influence of the temperature and pH on the antimicrobial effect was studied also.Meanwhile，the preliminary preservation test of fruit and vegetable was conducted.The results showed that ethanol extract of pomelo peel had a strong antimicrobial activity to Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Saccharomyces cerevisiae and the minimum inhibitory concentration was as follow:6.25%，12.5%，12.5%，respectively，but no significant effect to the Escherichia coli and Aspergillus niger.The antimicrobial effect was little affected by temperature，while influenced largely by pH and strong effect in acid condition.The ethanol extract from honey pomelo peel had better antimicrobial and preservation effect，and could be developed as a natural food preservative agent.

honey pomelo peel;ethanol extract;antimicrobial effect;preservation effect

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0165－04

2011－09－01

郑艺梅(1966－)，女，博士，教授，研究方向:农产品贮藏与加工、食品营养与安全等。

漳州师范学院引进人才启动基金(L20919);福建省教学质量与教学改革工程项目(闽教高［2011］69号);漳州师范学院2010年大学生创新性实验计划项目(201008)。