抗菌肽BUFORINⅡ衍生物的生物活性研究

郝 刚，乐国伟，施用晖，唐俊妮

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041; 2.江南大学食品学院，江苏无锡214122)

抗菌肽BUFORINⅡ衍生物的生物活性研究

郝 刚1，乐国伟2，施用晖2，唐俊妮1

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041; 2.江南大学食品学院，江苏无锡214122)

研究了抗菌肽BF2－A/B的抗菌活性及其他的生物活性。两个肽均具有很强的广谱抗菌活性，BF2－B对细菌的抑菌活性比BF2－A强，它们没有体外溶血活性。BF2－A几乎没有细胞毒性，而BF2－B在100μg/mL时，能抑制大约20%的肿瘤细胞生长。两个肽均能结合脂多糖，中和内毒素，BF2－B与脂多糖的亲和结合力比BF2－A强。BF2－A/B经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抗菌活力都略有下降，而经蛋白酶K处理一段时间后，就完全丧失了抗菌活性。

抗菌肽，BuforinⅡ，衍生物，生物活性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胃蛋白酶 上海生物工程有限公司;胎牛血清、RPMI1640 华美生物工程有限公司;胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)Sigma公司;蛋白酶K Merck产品;显色基质鲎试剂盒 厦门鲎试剂实验厂有限公司。

HYG－A型恒温调速摇床柜 江苏太仓市实验设备厂;Multiskan MK3酶联免疫检测仪 美国Thermo公司;UV－2102 PCS紫外可见分光光度计优尼科有限公司;CO2培养箱 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 衍生肽BF2－A/B抗菌活性的测定 按最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)测定法［6］检测衍生肽BF2－A/B对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等G+、G－菌及白色念珠菌、酿酒酵母等真菌的抗菌活性。

表1 抗菌肽BF2－A/B的最低抑菌浓度MIC(μg/mL)

1.2.2 抗菌肽对细菌的抑菌曲线 将培养至对数生长期的大肠杆菌菌液加入到试管中，再加入抗菌肽溶液，使其终浓度分别为5μg/mL和10μg/mL，对照组加等量无菌水。37℃水浴摇床培养，每隔30min用分光光度计测630nm处的OD值。金黄色葡萄球菌也做同样处理。

1.2.3 抗菌肽体外溶血实验 收集新鲜小鼠全血，肝素抗凝，4℃3000r/min离心10min取沉淀，生理盐水洗涤并按8%(v/v)重悬。100μL的红细胞悬液与100μL不同浓度的抗菌肽溶液混匀。混合体系放置于37℃恒温箱中，孵育1h，取出并在4℃ 3000r/min离心10min，取上清液，使用酶标仪测570nm处吸光值。以具有溶血活性的抗菌肽Melittin(蜂毒素)作为阳性对照。对照组:1:0.1%TritionX－100 100μL; 2:15μL水加生理盐水补齐至100μL。溶血百分比值按下式计算:溶血(%)=(抗菌肽组吸光值－对照组2吸光值)/(对照组1吸光值－对照组2吸光值)×100%。

1.2.4 抗菌肽抑制肿瘤细胞Hep－G2体外增殖的活性(MTT比色法) 将人肝癌细胞Hep－G2接种于含有10%灭活的胎牛血清，青霉素100U/mL和链霉素100U/mL的RPMI1640培养液中，于37℃，5%CO2饱和湿度下培养至对数生长期，0.25%胰酶消化，用1640完全制备细胞悬液5×104CFU/mL。取100μL细胞悬液于96孔板中，培养24h。加入100μL经微孔滤膜过滤除菌的不同浓度的抗菌肽，对照组加100μL培养液，37℃，5%CO2培养24h。弃去旧液，加入100μL新培养液，同时每孔加入20μL，5g/L MTT溶液，继续培养4h。4℃、1500r/min离心5min，弃去上清液，加入100μL二甲基亚砜，37℃放置10min，待晶体溶解完全后，用酶标仪于570nm处测OD值。以抗菌肽Magainin 2作为阳性对照。细胞存活率(%)=抗菌肽组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.5 衍生肽结合脂多糖(LPS)中和内毒素的活性方法按显色基质鲎试剂盒说明书，略作修改，简述如下:在置于冰浴中的各试管中加入0.1mL的鲎试剂溶液，依次加入10μL 1EU/mL的内毒素母液及10μL不同浓度的抗菌肽BF2－A/B，补加80μL内毒素检测用水，混匀并在37℃孵育45min。各管加入显色基质溶液0.1mL，混匀，再置于37℃孵育6min。取出置于冰浴中，各管均加入0.5mL反应终止液(盐酸+偶氮化试剂1)，使反应终止并开始染色。依次加入偶氮化溶液2、3号各0.5mL于试管中，混匀，然后静置5min，用分光光度计于波长545nm处测吸光度。阳性对照组:加入10μL 1EU/mL的内毒素母液，再补加90μL检测用水。内毒素中和率(%)=(阳性组吸光值－抗菌肽组吸光值)/阳性组吸光值×100%。

1.2.6 衍生肽抵抗不同蛋白酶水解的能力 用浓度为1mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37℃下分别处理抗菌肽不同时间后，取100μL置于96孔培养板中，然后加入100μL的待测菌液，抗菌肽浓度为5倍MIC。对照组为未加酶处理抗菌肽100μL，37℃培养3h。利用Hultmark改进法［7］测抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活力。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽BF2-A/B的抗菌活性检测

衍生肽BF2－A/B的抗菌活性用最低抑菌浓度来表示，结果如表1所示。总体上来看，经过重新设计过的抗菌肽BF2－B无论对G+菌还是G－菌的抗菌活性要比其母肽BF2－A更强。而且，这两个衍生肽对革兰氏阳性菌的抑菌活性普遍要比革兰氏阴性菌强，BF2－B尤其明显。但对真菌的抑菌活性，总体上BF2－B又不如BF2－A强，这可能与它们对抑制细菌和真菌活性的机理不同有关。

2.2 抗菌肽对细菌的抑菌曲线

我们选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为G－、G+菌的代表，考察抗菌肽BF2－A/B对细菌的抑制曲线，结果如图1所示。当抗菌肽加入到菌悬液后，都能抑杀大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，但其抑菌活性却不一样。无论是高浓度(10μg/mL)还是低浓度(5μg/mL)，BF2－A所导致的细菌死亡均是一个非常缓慢的过程，而BF2－B的抑菌过程迅速剧烈，BF2－B明显强于BF2－A，并且5μg/mL BF2－B的抑菌活性比10μg/mL的BF2－A还强。虽然浓度从5μg/mL增加至10μg/mL，但BF2－A的抑菌活性并没有明显的增强，而浓度的提高对BF2－B的抗菌活性的增强则有非常显著的影响。这些现象说明，抗菌肽BF2－B对细菌的杀伤活性可能与它的剂量有关，而BF2－A则不是一个明显的浓度依赖性的抗菌肽。同时说明，BF2－A/B两者在抑杀细菌的机理上，可能会有所不同。对比大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌曲线，两个肽对这两种代表菌的抑菌特性没有显示出明显的不同，说明BF2－A/B对G+、G－菌的抑菌机理可能是一样的。

图1 抗菌肽BF2－A/B对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌曲线

2.3 抗菌肽体外溶血活性

随后我们考察了抗菌肽BF2－A/B在不同浓度下，对小鼠红血球的溶血率，见表2。即使在10倍MIC浓度下，BF2－A/B都没有溶血活性，只有在80μg/mL的浓度下，BF2－B才显示出轻微的溶血率。蜂毒素Melittin是一个分离自蜜蜂毒液的阳离子抗菌肽，它是以破坏细菌细胞膜的方式来抑菌的，具有溶血活性。从表2中可以看出在高于20μg/mL时，其就能导致完全的溶血。这个结果说明，BF2－A/B对哺乳动物细胞几乎没有细胞毒性，很适合开发成抗菌药物。

表2 抗菌肽BF2－A/B体外溶血活性

2.4 抗菌肽抑肿瘤细胞活性

衍生肽BF2－A/B处理后的肿瘤细胞存活率用标准的MTT方法来检测。抗菌肽Magainin 2是一个具有抑肿瘤活性但没有溶血活性的肽，如图2所示，当Magainin 2浓度高于20μg/mL后，细胞存活率急剧下降。在低于100μg/mL浓度时，BF2－A几乎没有抑肿瘤活性，BF2－B也只是在高于50μg/mL后，才显示出了轻微的抑肿瘤活性，在100μg/mL时，可达到大约20%的抑制率。

2.5 衍生肽中和内毒素的活性

革兰氏阴性菌的细胞外膜的外单层上分布着大分子的醣脂类物质——脂多糖。在杀伤细菌的过程中，抗菌肽必须要和这层外膜相互作用。阴离子的脂多糖是细胞外膜的外侧唯一的脂质种类，阳离子抗菌肽与细菌最初的相互作用是经过脂多糖来结合的。脂多糖是内毒素的首要成分，因此与脂多糖的结合可以用内毒素的中和作用来检测。肽对内毒素不同的中和能力代表了与脂多糖相对结合亲和力。如表3所示，两个肽都显示出了对脂多糖相对不同的亲和性。在相同浓度下，BF2－B内毒素中和率比BF2－A高，则它和脂多糖的亲和结合能力就比较强，这也许是由于它携带了比BF2－A更多的正电荷。随着浓度不断地提高，两个肽与脂多糖的结合亲和力也越强。抗菌肽对内毒素的中和能力被认为贡献了部分的抗菌活性，因此，这解释了拥有与脂多糖较高亲和能力的BF2－B的抗菌活性之所以比BF2－A强的原因;同时这样的结果也说明静电相互作用在杀菌过程中是相当重要的。

图2 抗菌肽BF2－A/B的抑肿瘤活性

表3 抗菌肽BF2－A/B与脂多糖的结合亲和性

2.6 衍生肽抵抗不同蛋白酶水解的能力

2.6.1 对胰蛋白酶稳定性 胰蛋白酶是专一性强的常用蛋白酶，其水解位点是Lys或Arg的羧基端肽键，抗菌肽BF2－A/B经该酶处理20min后，抗菌活性立即下降，此后抗菌活性基本不变。造成这种现象的原因可能由于:两个肽的分子中尽管含有Lys或Arg，可能在与细菌作用时，其空间构象发生改变，有些肽的碱性氨基酸与细胞外壁结合，胰蛋白酶不易于作用其上，因此还体现出一定的活性;或者虽然被胰蛋白酶水解去除一两个氨基酸，但剩下的片段仍然具有不完全的抗菌活性。

图3 胰蛋白酶对抗菌肽抗菌活性影响

2.6.2 对胃蛋白酶稳定性 胃蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，它断裂Phe、Trp、Tyr等疏水氨基酸的羧基端肽键，两个肽都含有Phe，随着胃蛋白酶作用时间的延长，抗菌活性持续下降，但抗菌活性并没有完全丧失，下降幅度不大，表明抗菌肽对胃蛋白酶具有一定的抵抗力。

2.6.3 对蛋白酶K的稳定性 蛋白酶K属于非专一性的水解酶，可水解任何蛋白质的肽键，两个抗菌肽随着酶作用时间的延长，抗菌活性显著下降，60min后，两个肽已经基本失去抗菌活性，说明抗菌肽对蛋白酶K的作用不稳定。

图4 胃蛋白酶对抗菌肽抗菌活性影响

图5 蛋白酶K对抗菌肽抗菌活性影响

3 结论

衍生肽BF2－A/B都有很强的广谱抗菌活性，BF2－B对细菌的抑菌活性普遍强于BF2－A。BF2－B杀菌过程迅速剧烈，BF2－A则非常缓慢。浓度的提高对BF2－A的活性没有明显的影响，而BF2－B是个浓度依赖性的肽。两个肽均没有体外溶血活性，而且BF2－A几乎没有抑肿瘤活性，但BF2－B在 100μg/mL时，能抑制大约20%的肿瘤细胞生长。BF2－A/B都能与脂多糖亲和结合从而中和内毒素，BF2－B亲和结合脂多糖的能力强于BF2－A。BF2－A/B经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抗菌活力都略有下降，而经蛋白酶K处理一段时间后，就完全丧失了抗菌活性。

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［3］Park CB，Kim MS，Kim SC.A novel antimicrobial peptides from bufo bufo gargarizans［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，218:408－413.

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［6］Hao G，Shi YH，Tang YL，et al.Design and analysis of structure－activity relationship of novel antimicrobial peptides derived from the conserved sequence of cecropin［J］.J Pept Sci，2008，14:290－298.

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Study on biological activity on the analogs of the antimicrobial peptide BuforinⅡ

HAO Gang1，LE Guo－wei2，SHI Yong－hui2，TANG Jun－ni1
(1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China; 2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The biological activities of antimicrobial peptides BF2－A/B had been studied.Both peptides showed powerful antimicrobial activities against a broad spectrum of microorganisms.The activity against bacteria of BF2－B was stronger than that of BF2－A.They didn’t display hemolytic activity.BF2－A was practically non－toxic，moreover，BF2－B exhibited about 20%of cytotoxicity at 100μg/mL.Both peptides could bind to lipopoysaccharide with relatively different affinities.BF2－B exhibited a higher binding affinity for LPS than BF2－A.After the treatment by pepsin and trypsin，the antimicrobial activities of BF2－A/B only decreased slightly.However，after the treatment by proteinase K for a while，BF2－A/B completely lost their activities.

antimicrobial peptide;BuforinⅡ;analog;biological activity

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)12－0132－04

随着上世纪七十年代瑞典科学家Boman等［1］在天蚕血淋巴中首次发现抗菌多肽，人们相继在两栖动物、昆虫、鱼类、哺乳动物等各种生物中都发现了大量的抗菌肽。抗菌肽不仅对细菌和真菌有广谱抗性，而且还能有效抑杀病毒、寄生虫，抑制肿瘤细胞生长，因此在医药、食品工业、畜牧业和农业领域具有广阔的应用前景［2］。抗菌肽BuforinⅡ是韩国学者Park等人［3］从亚洲蟾蜍的胃组织中分离纯化的有21个残基的抗菌肽。Park等人在研究BuforinⅡ的构效关系时，在其N－端截去了4个冗余残基后产生了一个衍生肽，它的抑菌活性比BuforinⅡ还要强［4］。在本实验室的前期研究中，我们将此衍生肽命名为BF2－A (RAGLQFPVGRVHRLLRK)，并在其结构特征基础上，设计并化学合成了一个新的衍生肽，命名为BF2－B (RAGLQFPLGRLLRRLLRRLLR)［5］。本文研究了这两个衍生肽的抗菌活性和抑菌曲线，体外溶血活性，体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，结合脂多糖的活性，以及抵抗各种蛋白酶水解的能力。

2010－09－10

郝刚(1978－)男，博士，主要从事抗菌肽设计与抑菌机理的研究。

国家自然科学基金(31071515);西南民族大学人才引进项目(2010RC04)。