白藜芦醇对线虫寿命的影响及分子机理研究

王 芳，田仕夫，邬树伟，刘常金

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

白藜芦醇对线虫寿命的影响及分子机理研究

王 芳，田仕夫+，邬树伟，刘常金*

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

目的:研究白藜芦醇延长寿命的效果和抗衰老的分子机理。方法:以模式生物秀丽线虫为材料，观察在正常(25℃)和热应激(35℃)培养条件下，空白对照组和终浓度为50mg/L和100mg/L的白藜芦醇药物组对秀丽线虫寿命的影响;用半定量RT-PCR方法对衰老相关基因Abnormal dauer formation protein 16(daf-16)、superoxide dismutase-3 (sod-3)、heat shock protein-16.2(hsp-16.2)的表达情况进行了分析。结果:在两种培养条件下，与空白组比较，药物组的线虫寿命都显著延长，且100mg/L终浓度白藜芦醇对线虫寿命延长作用更显著;药物组衰老相关基因表达上调。结论:白藜芦醇通过上调daf-16、sod-3和hsp-16.2基因的表达实现对秀丽线虫寿命的延长，研究结果为白藜芦醇抗衰老机制研究提供重要参考。

白藜芦醇，秀丽线虫，寿命相关基因，半定量RT-PCR

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司惠赠;5-氟脲嘧啶(5-Fu) 美国sigma公司;羟丙基环糊精 广州泰龙生化公司;TRIZOL试剂 美国Invitrogen公司;逆转录酶及Taq DNA聚合酶 北京全式金生物技术有限公司;核酸染料(gelview) 北京百泰克生物技术有限公司;大肠杆菌OP50 由美国线虫中心CGC提供;野生型线虫N2 由北京生命科学研究所惠赠。

凝胶成像分析仪及普通PCR仪(MyCycler 170-9703) 美国Bio-Rad公司;移液器、小型离心机德国Eppendorf公司;电泳仪 北京六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇的环糊精包埋 白藜芦醇是非水溶的天然产物。羟丙基环糊精可溶于水，是很好的包埋剂。经本实验室研究表明，可用羟丙基—环糊精以一定比例对白藜芦醇进行包埋。

在40mL无水乙醇中缓慢加入2g白藜芦醇，并不断搅拌至白藜芦醇全部溶解。向30mL蒸馏水中缓慢加入20g环糊精并不断搅拌至环糊精全部溶解。再将溶解有环糊精的30mL液体放入温度设为37℃的恒温加热磁力搅拌器上。将白藜芦醇的乙醇溶液以3mL/min的速率逐滴加入到不断搅拌的环糊精水溶液中。50℃、80r/min真空旋蒸至酒精完全挥发，时间不宜太长，防止白藜芦醇氧化。待白藜芦醇的乙醇溶液完全加入到环糊精水溶液中后，避光保存于4℃冰箱中。

1.2.2 线虫寿命观察

1.2.2.1 线虫的喂养 线虫的培养使用线虫标准培养基(NGM)，根据文献［3］配制。E.coli OP50用作线虫的食物。培养温度为25℃。

1.2.2.2 线虫的同期化 当需要同期化线虫数目较多时，采取高氯酸钠漂白法。准备孕虫生长板2～3个。

a.用无菌蒸馏水冲洗孕虫生长板，将含孕虫的蒸馏水吸入1.5mL离心管中，1500×g离心3min，弃去上清液。

b.加入1mL新配同期化漂白液，室温下剧烈震荡3min，以将成虫虫体腐蚀。

c.2000×g离心3min，弃去上清。b与c步骤总时间不能超过7min，否则将损伤虫卵。

d.用无菌蒸馏水将沉淀重悬，混合后1000×g离心3min，弃去上清。

e.将沉淀混匀，取NGM培养皿，将重悬后的沉淀接种至培养皿中，约200μL/板接种。

附：线虫同期化试剂(5mL)：NaOH(0.5mol/L) 0.5mL，NaClO(8%～9%)0.5 mL，H2O 4.0mL。

1.2.2.3 线虫寿命观察 实验设定空白对照组(白藜芦醇终浓度为0mg/L)、低浓度药物剂量组(白藜芦醇终浓度为50mg/L)、高浓度药物剂量组(白藜芦醇终浓度为100mg/L)，每组90条线虫，每平板30条。

a.正常培养温度(25℃)下线虫寿命的观察：把白藜芦醇加入到 NGM培养基中配成不同终浓度(50mg/L、100mg/L)的培养液，然后将 E.Coli OP50涂布到配制好的NGM培养基上。使用次氯酸钠溶液对秀丽线虫进行同步化，把新孵出的L1期线虫在涂有E.coli OP50的NGM培养皿中进行培养。当线虫进入产卵期(第 3.5d)时，把线虫转移至加有400μmol/L FUDR的培养基，以抑制卵的孵出。在25℃的培养箱中培养。在从加药处理开始的10d内，每隔一天把线虫转移至新配制的培养皿中，10d后不用药物处理。在10d中，每隔一天换一次培养基，线虫寿命统计从转板的第二天开始，每天详细记录线虫死亡数。数量统计采用双盲(double-blind)统计方法。

b.热应激(35℃)条件下线虫寿命的观察：对照组不用药物处理，药物处理组分别用终浓度为50mg/L和100mg/L的培养基预处理处于L1期的线虫48h，然后转移到35℃的培养箱中进行热应激。每半小时计数死亡虫子的数目并做详细记录。数据统计采用双盲的统计方法。

1.2.3 线虫寿命相关基因的表达分析

1.2.3.1 线虫RNA提取 线虫同期化孵出幼虫后，继续在平板上培养5d，采用TRIZOL法提取25℃条件下空白对照组(0mg/L)和寿命延长最显著的药物实验组(100mg/L)总RNA，琼脂糖电泳确定其完整性。提取的RNA通过直接用作模板，用ama-1引物做PCR进行纯度检验，如无扩增条带则认为无DNA污染，如有扩增条带则进一步用RNase free的DNaseI消化，确定无DNA污染后再用作RT-PCR模板。

1.2.3.2 PCR反应条件及引物 PCR反应条件：94℃，4min(1个循环);94℃，30s，55℃(可变)，30s，72℃，50s(30个循环);72℃，10min。相关引物如下，由上海生物工程有限公司合成。

daf-16：TTCCCCTTTCTCTCGTCTAATTC(上游)和CATCATCATCATACAGTCTCAAA(下游)。

sod-3：AGTAGTAGGCGTGCTCCCAA(上游)和TGTGCTGACACCGAAATGTT(下游)。

hsp-16.2：CGTCGAAGAGAAATCTGCTGAA(上游)和TGCAGCGAACAATACTGTAATTTATG(下游)。

ama-1：GGACGACGTGTTCCTACGAT(上游)和GTTGGCGAATAACTGGGAGA(下游)。

1.2.4 数据处理工具与统计方法 寿命实验及应激实验的数据使用SPSS 16.0的Kalpan-Meir存活曲线分析程序分析。加药处理组和对照组之间的比较使用SPSS 16.0的Kaplan-Meier Log-rank两两比较程序分析，由此计算出p值来表示其显著性。如果p＜0.05则表示有显著差异;p＜0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度白藜芦醇对线虫寿命的影响

2.1.1 正常培养条件下(25℃)白藜芦醇对线虫寿命的影响 本实验采用环糊精包埋的白藜芦醇，其水溶性更好，在培养基中可均匀分布，增强了数据的准确性。

在正常培养条件下(25℃)观察统计白藜芦醇对线虫寿命的影响，结果显示，与空白对照组(0mg/L)相比，低剂量药物组(50mg/L)线虫平均寿命提高了14.06%(p＜0.01)，高剂量药物组(100mg/L)线虫平均寿命提高了22.10%(p=0.001)，药物组的最大寿命也长于对照组。对线虫全程生存情况做生长曲线，两种剂量的白藜芦醇均能使曲线右移，而且高剂量组对寿命的延长效果好于低剂量组(见图1)，可见，在一定浓度范围内，白藜芦醇对线虫寿命的影响具有剂量依赖性。

图1 25℃培养条件下线虫生长曲线

2.1.2 热应激条件下(35℃)白藜芦醇对线虫寿命的影响 在热应激条件下(35℃)观察统计白藜芦醇对线虫寿命的影响，结果表明，与空白对照组(0mg/L)相比，低剂量药物组(50mg/L)线虫寿命提高了11.87%(p＜0.05);高剂量药物组(100mg/L)线虫寿命提高了22.64%(p＜0.05)，药物组的最大寿命也长于对照组。对线虫全程生存情况做生长曲线，两种剂量的白藜芦醇均能使曲线右移，且高剂量组(100mg/L)延长线虫寿命效果更为明显(见图2)。可见，在热应激条件下，在一定浓度范围内，白藜芦醇对线虫寿命的延长也具有剂量依赖性。

图2 35℃培养条件下线虫生长曲线

2.2 白藜芦醇对线虫衰老相关基因的影响

线虫用100mg/L的白藜芦醇喂食5d后，线虫内衰老相关基因发生变化，通过半定量RT-PCR法分析其变化情况。以管家基因ama-1为内参，与空白对照组相比，高剂量药物组的基因daf-16、sod-3、hsp-16.2的表达都明显上调(见图3)。

daf-16是胰岛素/胰岛素样生长因子-1(Insulin/ IGF-1)信号通路中编码转录因子FOXO的基因，它被磷酸化后不能进入细胞核，未被磷酸化的形式能向细胞核内转移，实现对寿命及免疫的调控［4］。当面临应激时，JNK-1促进daf-16向核内转移，从而激活相关基因并提高线虫抵抗环境应激的能力［4］。研究表明sod-3和hsp-16.2是位于daf-16下游的效应因子，作为胁迫感应器延长线虫寿命［5-6］。sod-3是编码超氧化物歧化酶(SOD)的基因，SOD能清除生命体内多余的超氧化物和自由基，过表达SOD可以减少氧化损伤并延长寿命［7］。hsp-16.2是一种分子伴侣，可以帮助蛋白正确折叠为天然构象，对寿命起到正调节作用［8］。

图3 线虫衰老相关基因的表达分析

3 结论

本研究利用模式生物线虫研究了白藜芦醇的抗衰老效果及其分子机理。研究发现，无论在正常条件还是热应激条件下，白藜芦醇对线虫均有显著的延长寿命的效果。基因表达分析实验表明，高剂量药物组的Insulin/IGF-1信号通路上游的转录因子daf-16表达上调，其下游的sod-3和hsp-16.2的表达量也相应增加。由此推测，白藜芦醇是通过上调Insulin/IGF-1信号通路中相关基因，提高线虫抵抗环境应激的能力从而延缓线虫衰老的。

该研究为白藜芦醇的应用提供了理论依据，为其抗衰老机理的研究提供了新内容。

［1］傅喆暾，张蓉，黄宝康，等.天然植物中活性成分白藜芦醇的作用研究进展［J］.现代中药研究与实践，2005，19(2): 62-64.

［2］Wood JG，Rogina B，Lavu S，et al.Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans［J］.Nature，2004，430:686-689.

［3］Brenner，S.The genetics of Caenorhabditis elegans［J］. Genetics，1974，77:71-94.

［4］Gami MS，Wolkow CA.Studies of Caenorhabditis elegans DAF -2/insulin signaling reveal targets for pharmacological manipulation of lifespan［J］.Aging Cell，2006，5(1):31-37.

［5］Rea SL，Wu D，Cypser JR，et al.A stress-sensitive reporter predicts longevityin isogenic populationsofCaenorhabditis elegans［J］.Nat Genet，2005，37:894-898.

［6］Hsu AL，Murphy CT，Kenyon C.Regulation of aging and agerelated disease by DAF-16 and heat-shock factor［J］.Science，2003，300:1142-1145.

［7］Ozkur MK，Bozkurt MS，Balabanli B，et al.The effects of EGb 761 on lipid peroxide levels and superoxide dismutase activity in sunburn［J］.Photodermatol Photoimmunol Photomed，2002，18 (3):117-120.

［8］Morley JF，Morimoto RI.Regulation oflongevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones［J］.Mol Biol Cell，2004，15(2):657-664.

The effect of resveratrol on Caenorhabditis elegans lifespan and its molecular mechanism

WANG Fang，TIAN Shi-fu+，WU Shu-wei，LIU Chang-jin*
(College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Objective:To study the extending longevity effect and anti-senescence molecular mechanism of resveratrol.Method:The lifespan assay was carried out on model organism Caenorhabditis elegans(C.elegans) which dieted resveratrol with final concentration 50mg/L and 100mg/L under normal culture conditions(25℃)and under heat stress(35℃)，respectively.Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of agingassociated genes such as daf-16，sod-3 and hsp-16.2.Result:Under the two kinds of culture conditions the C.elegans fed resveratrol was shown to extend lifespan compared to the control without resveratrol uptake. Furthermore，the resveratrol with final concentration 100mg/L had more obvious longevity-extending effect.The expression of aging-associated genes was up-regulated.Conclusion:The results suggested that resveratrol significantly extended the lifespan of C.elegans through up-regulating some genes’expression such as daf-16，sod-3 and hsp-16.2 which would provide important reference for antiaging research of resveratrol.

resveratrol;Caenorhabditis elegans;aging-associated genes;semi-quantitative RT-PCR

TS201.2

A

1002-0306(2011)12-0126-03

白藜芦醇的抗衰老、抗氧化生理活性已得到了广泛认可［1］，但对于其分子机理的研究较少，目前研究认为：白藜芦醇作为限食(Caloric Restriction)的一种模拟物，可以通过与限食类似的机理延长模式动物寿命的作用。如Wood等发现［2］，100μmol/L的白藜芦醇可模拟限食作用来激活基因SIR-2.1，从而延长野生型线虫的寿命达14%。而利用野生型Canton-S果蝇进行的寿命实验中，100μmol/L的白藜芦醇可延长果蝇的寿命达29%。对于白藜芦醇是否还具有其它抗衰老的分子机理有待进一步研究，本实验通过研究白藜芦醇对线虫在正常条件下(25℃)和热应激(35℃)条件下的寿命影响以及相关基因表达分析，探索了白藜芦醇对秀丽线虫寿命影响的分子机理，为深入研究其作用机制提供重要理论参考。

2010-10-27 *通讯联系人，+为并列第一作者。

王芳(1975-)，女，博士，讲师，研究方向:植物基因工程与分子生物学。田仕夫(1984-)，男，在读硕士，研究方向:生物化学与分子生物学。

天津科技大学实验室开放基金项目资助。