VEGF-D表达与下咽癌组织淋巴管生成及预后的相关性

王 莹李文媛 岳文江王景霞

(牡丹江医学院解剖教研室;1牡丹江医学院第二附属医院五官科,黑龙江157011;2佳木斯大学组胚教研室,黑龙江 154007)

VEGF-D表达与下咽癌组织淋巴管生成及预后的相关性

王 莹＊李文媛 岳文江1王景霞2

(牡丹江医学院解剖教研室;1牡丹江医学院第二附属医院五官科,黑龙江157011;2佳木斯大学组胚教研室,黑龙江 154007)

目的 探讨血管内皮生长因子-D(Vascular endothelial growth factor D,VEGF-D)在下咽癌组织中的表达规律、与淋巴管密度(LVD)、淋巴结转移之间的关系及其在下咽癌预后中的意义。方法 采用Western-bolt方法检测6例下咽癌和6例正常下咽组织中VEGF-D蛋白的表达情况,以45例经病理确诊的下咽癌组织为实验组,15例下咽良性病变组织为对照组,采用免疫组化SP法对上述组织中VEGF-D蛋白的表达进行分析,同时采用5′-核苷酸酶染色法(5′-Nase)计数淋巴管密度(LVD),并结合临床病理特征和生存资料进行相关分析。结果 ①Western-bolt结果显示下咽癌组织中VEGF-D的表达量较正常组织明显增加。②在下咽癌组织中VEGF-D的阳性率为44.4%,明显高于在良性病变组织的表达水平(P<0.05)。③VEGF-D表达与LVD、淋巴结转移、淋巴管浸润显著相关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤部位及组织学分级无关(P>0.05)。③Kaplan-Meier生存曲线分析VEGF-D的表达与生存率不相关(P>0.05)。结论 VEGF-D促进下咽癌淋巴管生成和淋巴管转移,但与下咽癌预后不相关。

血管内皮生长因子-D; 下咽癌; 淋巴管生成

下咽癌是我国常见的头颈部恶性肿瘤之一,其 中癌细胞淋巴道转移是下咽癌最重要的转移方式和最主要的预后因素之一[1],因而研究下咽癌淋巴管生成和转移机制具有的重要的临床价值。目前最具代表性的淋巴管生成因子有VEGF-C和VEGF-D,它们是VEGF家族的重要成员,通过激活淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3可促进淋巴管内皮细胞增殖分化并诱导淋巴管生成[2-4]。许多研究报道已证实 VEGF-C的表达与胃癌[5]、肺癌[6]、甲状腺癌[7]、前列腺癌[8]、食管癌[9]和结肠癌[10]淋巴道转移关系密切。但关于VEGF-D与下咽癌淋巴管生成及其预后的关系的研究报道较少。为此,本研究探讨了VEGF-D在下咽癌中的表达及其与淋巴管密度、淋巴结转移和下咽癌预后的关系,为下咽癌的诊治研究提供新的思路。

材料和方法

1 一般资料

取中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科2005年1月-2009年3月首次手术治疗的原发下咽癌患者,共计45例。病人年龄41至86岁,术前未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。生存资料通过信访或电话获得,生存期开始时间自手术日期始,至2009年8月1日止。生存期计算以月为单位,未满整月以实际生存天数计算。随访期限为3月-71月,中位数为31月。死亡病例均由复发或转移引起。所有标本均经病理确诊(参考 UICC1997年标准TNM分期),同时收集的20例正常喉良性病变用于对照。患者临床病理因素信息见表1。免疫组化标本经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋,制成4μ厚的切片。酶组化标本经-20℃恒冷箱冰冻切片机切片,厚10-20μm。置于含7%蔗糖和6%多聚甲醛固定液中2h,作5′-Nase染色。

2 主要试剂

二甲胂酸钠,腺苷-5′-磷酸钠,萘酚 AS-MX磷酸钠,左旋咪唑,固蓝BB盐,二甲基甲酰胺(DMF)均购自美国SIGMA公司。兔抗人VEGF-D多克隆抗体(1:100)及S-P试剂盒均购自北京中杉公司技术有限公司。

3 免疫蛋白印迹(Western blotting)

将组织剪碎后加入0.5 mL不含去污剂的可溶性蛋白裂解液冰上放置30 min进行匀浆[5],离心,12000g 30 min,取上清。Bradford法进行蛋白定量。加上样缓冲液,水浴煮沸5 min,冰上冷却。等量上样后进行SDS-PAGE电泳,5%浓缩胶(88 V,30 min),10%分离胶(110 V,30 min),然后湿转到PVDF膜上(60 V,2 h),5%脱脂奶粉(用 TTBS配制)室温封闭2 h,分别加兔多克隆抗体抗VEGF-D抗体(1:200)4℃冰箱过夜,TTBS洗膜,分别与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(1:5000)室温1h,TTBS充分洗涤,ECL发光。

表1 病人临床病理因素统计表Table 1 The clinical parameters in patients with laryngeal carcinoma

4 免疫组织化学染色

石蜡切片常规脱蜡至水。滴加过氧化酶阻断溶液,消除内源性过氧化酶的活性,室温下孵育10min,PBS冲洗。滴加正常山羊血清封闭液,室温20min,甩去液体后分为二组:一组滴加兔抗人VEGF-D多克隆抗体(工作浓度1:100);另一组滴加PBS缓冲液替代一抗,作为空白对照组。室温1h,PBS冲洗。滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG,室温20min,PBS冲洗。滴加试剂SABC,室温20min,PBS冲洗,显微镜下控制。自来水充分冲洗后,苏木素轻度复染,中性树胶封固镜下观察。

5 酶组化染色方法

冰冻切片吹干后,分两组:A组作双重染色,即将切片置入5′-Nase标准液(反应液Ⅰ)内,37℃孵育40min。水洗后入1%硫化铵内2min,再入ALP标准液(反应液Ⅱ)37℃下孵育60min。水洗后封片,光镜下观察结果。反应液Ⅰ内含有0.2mol/L的 Tris-顺丁稀二酸缓冲液(ph7.2)20ml,腺苷 5′-磷酸钠 (5′-AMP)25mg,硫酸镁 123mg,硝酸铅60mg,蔗糖3g,蒸馏水22ml;反应液Ⅱ含有:萘酚AS-MX磷酸钠40mg,DMF2ml,0.1mol/L的 Tris-HCL缓冲液(p H7.2)40ml,固蓝BB盐40mg;B组只作5′-Nase染色,反应液 Ⅰ内加入 20mg左旋咪唑。C组作对照实验,将孵育液中的底物去除,即再反应液Ⅰ内不加腺苷5′-磷酸钠,反应液Ⅱ内不加萘酚AS-MX磷酸钠,其余步骤同A组。

6 结果判定

6.1 LVD 测定

将酶组织化学染色好的切片置于带显微图像分析系统的显微镜下进行淋巴管密度测定,计数者在临床病理资料均不知晓的情况下计数,先在低倍镜(10×10)下分别选择肿瘤淋巴管的密集区,即“热点”(hostpost),然后在高倍镜(10×20)下计数5个视野的淋巴管数目,取其平均值为每个标本的淋巴管密度,以淋巴管数目/高倍视野(个/HPF)表示。

6.2 VEGF-D判定标准

采用半定量积分法判定,阳性信号为棕黄色。VEGF-D蛋白免疫组化阳性表达位于细胞浆和胞膜,呈棕黄色颗粒团块。随机选取5个高倍视野按阳性细胞比例及着色程度记分,行半定量分析。无着色细胞记为0分;着色细胞比例≤1/3记为1分;1/3﹤着色细胞比例≤2/3记为2分;着色细胞比例>2/3记为3分。浅黄色记为1分,棕黄色记为2分,棕褐色记为3分;然后根据二者乘积判断阳性结果:二项乘积≤3分记为(—);>3分记为(+)。

7 统计方法

所有数据建立EXCEL数据库,应用SPSS11.5统计软件进行处理。计数资料采用χ2检验,相关分析采用 Spearman法,Kaplan-meier法作生存率曲线,Log-rank法作时序检验;以 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 VEGF-D在下咽癌组织和正常下咽组织中的表达

Western-bolt检测了6例下咽癌组织和6例正常下咽组织中VEGF-D蛋白的表达。以VEGF-D蛋白条带的积分光密度值同与之配对的内参照βactin带的积分光密度值的比值(即β-actin校正值)表示VEGF-D蛋白相对表达量。患者下咽癌组织和正常下咽组织中VEGF-C蛋白的相对表达量分别为:0.86 ±0.12、0.68 ±0.11(P<0.05)。从结果可见,下咽癌组织中VEGF-D表达较正常喉组织明显增多(图1)。

图1 VEGF-D蛋白在下咽癌(1,3)与配对良性下咽组织(2,4)中的表达 。＊与肿瘤组织比较 P<0.05Fig1 The expression level of VEGF-D in hypopharyngeal cancer and normal tissue(1,3 hypopharyngeal cancer;2,4 normal tissue).＊compared with tumor tissueP<0.05

2 VEGF-D在下咽癌组织中的表达

通过 HE染色,明确下咽癌病理分型(见图2),VEGF-D蛋白免疫组化阳性表达位于细胞浆和胞膜,呈棕黄色颗粒(见图3),阴性细胞胞浆不着色。5′-Nase特异性地表达在下咽癌组织中毛细淋巴管内皮细胞,在光镜下可见呈棕黄色的点状(横切面)或条状(纵切面)(见图4),血管内皮细胞和肿瘤细胞未见表达。VEGF-D阳性表达在下咽癌组织表达显著高于正常组织(P=0.026),VEGF-D在下咽癌中阳性表达率 44.4%,在各种临床因素中,VEGF-D蛋白表达与淋巴管密度(P=0.006)、淋巴结转移(P=0.010)与淋巴管浸润(P=0.001)密切相关(P<0.01),但与病人的年龄、性别、肿瘤部位、T临床分期、组织学分级无统计学意义的差异性(P>0.05)(见表 2)。

3 VEGF-D表达与生存率的关系

按VEGF-D表达的不同将下咽癌患者分为两组((-)为阴性(+)为阳性),Kaplan-Meier生存分析绘出下咽癌患者整体生存曲线,VEGF-D阳性表达平均生存时间为50个月,阴性表达组平均生存时间为60个月,通过 Kaplan-meier生存分析绘出曲线,Log-rank检验表明两组生存率无显著性差异(P=0.445)(见表 3)。

图4 淋巴管(→)呈棕色,毛细血管(B)淡染或不着色。A.良性下咽组织(×200);B.下咽癌组织(5′-Nase染色 ×400)。Fig 4 The lymphatic capillayies(→)were seen brown,no colour was seen in the blood capillaries(B). A. normal tissues(×200);B.hypopharyngeal carcinoma(5′-Nase method ×400).

表2 下咽癌中VEGF-D的表达与临床病理参数的关系Table 2 Correlations of expressions of VEGF-D to clinicopathologic features of hypopharyngeal cancer

表3 Kaplan-Meier生存分析绘出下咽癌患者整体生存曲线,根据VEGF-D表达,两组曲线无显著差异(log rank P=0.445).Table 3 Kaplan-Meier curve for the overall survival of the patients with hypopharyngeal cancer,according to the expression VEGF-D.The two curves are not significantly different(log rank P=0.445).

讨 论

浸润与转移是恶性肿瘤的重要生物学特性,淋巴管是实体肿瘤转移的最早通路之一。淋巴管生成作为肿瘤淋巴转移的机制已被多数学者认可,但其分子机制尚未明了。许多研究报道已证实VEGF-C表达与多种人类肿瘤淋巴管转移关系密切[6-10],但目前VEGF-D与淋巴管转移的关系研究相对较少,且无一致的结论,大多数研究者认为VEGF-D可能通过与VEGF-C相同或相似的模式发挥其生物学效应,促进肿瘤淋巴管生成和转移。但也有实验表明[11]在头颈部鳞癌中,与正常细胞相比,肿瘤细胞株中VEGF-α和VEGF-C表达增加,而VEGF-D表达降低;Strauss等[12]也发现头颈部鳞癌中伴有颈部淋巴结转移患者较无淋巴结转移者VEGF-D表达降低。本文研究发现下咽癌组织中VEGF-D与下咽癌淋巴管密度、淋巴结转移和淋巴管浸润显著相关,而与年龄、肿瘤 T分期、肿瘤的分化程度及生长部位不相关。下咽癌中VEGF-D与LVD表达的相关性表明在下咽癌组织中发现的淋巴管与VEGF-D密切相关,并非是机体中原有的淋巴组织在肿瘤的侵润过程中被肿瘤吞噬后包含于肿瘤组织中,而是新生的淋巴组织。证实了肿瘤的生长发展过程中发生了淋巴管生成的现象,并且这种淋巴管生成与肿瘤的淋巴管浸润和淋巴结转移密切相关。

目前VEGF-D对肿瘤预后的相关报道尚不多见,且争议较多。有报道显示VEGF-D可作为结肠癌淋巴管侵润转移时独立预测整体生存率的标记[13]。有研究者认为VEGF-D和 VEGFR-3也是胃腺癌和上皮卵巢癌[19]预后不良的标记。但 Gisterek[14]认为VEGF-C和VEGF-D表达程度与肺癌患者预后无关。本实验通过 Kaplan-Meier生存分析绘出45名下咽癌患者整体生存曲线,Log rank检验表明VEGF-D阳性表达与生存曲线显著不相关。然而,因为此研究是针对一组有限下咽癌患者数量回顾性研究,所以VEGF-D与下咽癌预后的关系仍有待于进一步大样本前瞻性的临床研究。

[1]黄选兆,汪吉宝.实用耳鼻咽喉科学.北京:人民卫生出版社.1998,10(1):502-504

[2]Alitalo K,Carmeliet P.Molecular mechanisms oflymphangiogenesis in health and disease.Cancer Cells,2002,1:219-227

[3]Joukov V,Pajusolak,Kaipaincn A,et al.A novel vascular endothelial growth factor,VEGF-C,is a ligand for the Flt-4(VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases.EMBOJ,1996,15:290-298

[4]AchenMG,JeltschM,Kukk E,et al.Vascular endothelial growth factor D(VEGF-D)is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor2(Flk-1)and VEGF receptor3(Flt-4).Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:548-553

[5]Yonemura Y,Endo Y,Fujita H,et al.Role of vascular endothelial growth factor C expression in the development of lymph node metastasis in gastric cancer.Clin Cancer Res,1999,5:1823-1829

[6]Salven P,Lymboussaki A,Heikkila P,et al.Vascular endothelial growth factors VEGF-B and VEGF-D are expressed in human tumors.Am J Pathol,1998,153:103-108

[7]Bunone G,Vigneri P,Mariani L,et al.Expression of angiogenesis stimulators and inhibitors in human thyroid tumors and correlation with clinical pathological features.Am J Pathol,1999,155:1967-1976

[8]Tsurusaki T,Kanda S,Sakai H,et al.Vascular endothelial growth factor-C expression in human prostatic carcinoma and its relationship to lymph node metastasis.Br J Cancer,2009,80:309-313

[9]Kitadai Y,Amioka T,Haruma K,et al.Clinicopathological significance of vascular endothelial growth factor(VEGF)-C in human esophageal squamous cell carcinomas.Int J Cancer,2008,93:662-666

[10]Furudoi A,Tanaka S,Haruma K,et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C expression and angiogenesis at the deepest invasive site of advanced colorectal carcinoma.Oncology,2002,62:157-166

[11]O-charoenrat P,Rhys-Evans P,Eccles S A.Expression of vascular endothelial growth factor family members in head and neck squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis.Cancer,2006,92(3):556-568

[12]Strauss L,Volland D,Kunkel M,et al.Dual role of VEGF family members in the pathogenesis of head and neck cancer(HNSCC):possible link between angiogenesis and immune tolerance.Med Sci Monit,2005,11(8):280-292

[13]Yokoyama Y,Charnock-Jones DS,Licence D,et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)-D and its receptor,VEGF receptor 3,as a prognostic factor in endometrial carcinoma.Clin. Cancer Res,2003,9:1361-1369

[14]Jüttners,Wissmann C,Jöns T,et al. Vascular endothelial growth factor-D and its receptor VEGFR-3:two novel independent prognostic markers in gastric Aden carcinoma. J. Clin.Oncol. 2006,24:228-240

The correlation of VEGF-D expression with lymphangiogenesis and prognosis in hypopharyngeal carcinoma

Wang Ying＊,Li Wenyuan,Yue Wenjiang1,Wang Jingxia2

(Department of A natomy,Mudanjiang Medical College,1The Second A f f iliated Hosptital Mudanjiang Medical College,Heilongjiang157011,2Department ofHistology and Emloryology,J iamusi University,Heilongjiang154007,China)

Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor-D(VEGFD)in patients with hypopharyngeal carcinoma,its relationship with lymphangiogenesis and lymph node metastasis,and its prognostic significance.Methods VEGF-D was observed by western blot in 6 hypopharyngeal cancer samples and 6 normal tissue samples.The expression of VEGF-D was observed by immunohistochemical staining in 45 hypopharyngeal carcinoma samples and 15 benign lesion samples.LVD was evaluated by 5′-Nucleotides staining and Kaplan-meier was used to judge the role of VEGF-D in hypopharyngeal carcinoma prognosis. Results ①Western blot results indicated that the level of VEGF-D was much higher in tumor tissue than in normal tissue.②In 45 laryngeal cancer samples,the positive rate of VEGFD was 44.4%,much higher than that in bening lesion(P<0.05). The expression of VEGF-D was significantly correlated with LVD,lymph node metastasis and lymphovascular invasion(P<0.01),but not with age,gender,histological stage,location and TNM stage(P>0.05). ③Kaplan-meier method indicated that there was no significant association between VEGF-D and survival ratio(P<0.05). Conclusion The expression of VEGF-D protein is correlated with lymphangiogenesis and lymphatic metastasis.But there is no significant association between VEGF-D and prognosis in hypopharyngeal carcinoma.

Vessel endothelium growth factor D; Carcinoma; Lymphangiogenesis

R322.3

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.014

2010-10-10

2010-11-01

王莹,男(1977年),汉族,讲师,在读博士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)