人外周血 Th细胞和 Tc细胞内 IFN-γ及IL-4表达水平与白塞病的关系

樊 超 郑劲锋 陈宏翔

(深圳市福永人民医院,深圳 518103)

人外周血 Th细胞和 Tc细胞内 IFN-γ及IL-4表达水平与白塞病的关系

樊 超 郑劲锋 陈宏翔

(深圳市福永人民医院,深圳 518103)

目的 检测BD患者外周血Th细胞和Tc细胞内INF-γ和IL-4的表达水平,探索BD患者体内的免疫状况。方法 采用流式细胞术检测BD活动期患者(n=22),BD稳定期(n=6)以及健康体检者(n=22)外周血T细胞亚群INF-γ和IL-4的表达水平。结果 BD患者活动期外周血细胞 Th细胞和 Tc细胞经过刺激后胞内合成IFN-γ的水平明显高于正常人水平(Th 细胞:22.45% ±7.33%vs. 16.32 ±4.96%,P<0.05;Tc 细胞:36.74% ±13.19%vs.28.67% ±11.56%,P<0.05),稳定期患者 Th细胞和Tc细胞体外合成IFN-γ的能力与正常人相比无明显差异;稳定期患者 Th细胞和 Tc细胞胞内合成 IL-4的能力相对于正常人均无明显差异:(稳定期 Th细胞:3.01%±1.38%vs.2.87%±1.46%,Tc细胞:1.14%±0.28%vs.1.07%±0.32%,P>0.05)。而活动期患者 Th细胞和 Tc细胞胞内合成 IL-4的能力相对于正常人均存在明显差异:(Th 细胞:3.54% ±1.62%vs. 2.87%±1.46%,Tc细胞:1.82% ±0.43%vs. 1.07% ±0.32%,P<0.05);导致 Th细胞和 Tc细胞有偏向 Th1及 Tc1的趋势(Th细胞 IFN-γ/IL-4:6.34±3.24 vs. 5.69±4.72,p>0.05;Tc细胞 IFN-γ/IL-4:20.19±13.65 vs. 26.79±14.52,P>0.05)。结论 BD 患者外周血 INF-γ和 IL-4的表达水平明显升高 ,并与疾病活动期存在一定程度相关,可能对白塞病患者的诊断具有重要的临床意义。

白塞病; γ-干扰素; 白介素-4

白塞病(Behcet’s disease)又称贝赫切特综合征(Behcet’s syndrome),是一种病因未明的自身免疫性疾病,缺乏特异性的实验室诊断指标和特殊的病理组织学改变,造成临床上对该病诊断困难,部分病例甚至长期误诊。目前,BD的发病机制尚不清楚,但越来越多的研究表明,免疫因素在BD发病中起重要作用。国外研究表明外周血 T细胞亚群INF-γ和IL-4的表达水平与疾病的发展存在一定的相关性[1,2]。本研究对22例BD患者外周血T细胞亚群INF-γ和IL-4的表达水平与疾病发展的相关性进行了探讨。

材料和方法

1.研究对象

2008年5月至2008年10月期间我院皮肤科门诊BD患者22例(14例女性,8例男性),所有BD患者均符合日本白塞病研究委员会1987年修订的诊断标准[6]。BD稳定期患者6例,为前22例患者中经治愈并已停药3个月的病例。正常人(normal control,N)22例,均来自年龄和性别匹配的健康体检者。

采集BD患者外周血标本时,有16例未接受任何治疗,4例仅接受中成药复方丹参针剂注射,还有2例接受复方丹参针剂注射和秋水仙碱治疗。6例接受治疗的患者在标本采集之前24小时均未进行任何治疗。

2.实验材料

2.1 仪器:FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences, San Diego,CA);CO2细胞培养箱(购自美国Forma公司);离心机(购自美国Sigma公司)。

2.2 试 剂:抗人 CD3-APC(ebioscience,Cat.NO.17-0037),抗人 CD8-FITC(ebioscience,Cat.NO.11-0088),抗 人 IL-4-PE(ebioscience,Cat.NO.12-7049); 抗 人 IFN-γ-PE-CY7(ebioscience,Cat.NO.25-7319);细胞内细胞因子固定剂与穿膜剂(ebioscience,Cat.NO:88-8823-88)

3.方法

FCM检测 Th和 Tc细胞细胞内细胞因子:分离人外周血单个核细胞(PBMC),调整细胞浓度至1×106个/ml,转至24孔培养板,每孔1ml细胞悬液 ,并加入 PMA 50ng/ml、ionomycin 750ng/ml、brefeldin A 20ug/ml,37℃,5%CO2培养箱培养;5h后收集体外刺激后的PBMC,1000 r/m离心10 min,弃上清,以5 ml PBS同法冲洗一次,加入100 μ1 PBS重悬细胞,然后加入20μ1的抗人CD3抗体和CD8抗体,室温避光孵育30 min。以5 ml PBS同样方法洗涤一次,尽量去除上清液,然后加入固定剂 500μ1,室温避光孵育 15 min,以 3 ml含 0.1%NaN3和5%FBS的PBS同法洗涤一次,尽量去除上清液,再加入穿膜剂100μ1、适量抗人 IFN-γ和抗人IL-4或相应的同型抗体ⅠgG1及 IgG2a,室温避光孵育30 min后,再以3 ml含0.1%NaN3和5%FBS的 PBS洗涤二次,最后用500μ1PBS悬浮后,上流式细胞仪进行检测。检测时,首先以 FSC及SSC设定淋巴细胞群 R1,然后以CD3和CD8分别设定CD3+CD8-细胞群 R2(Th细胞)及 CD3+CD8+细胞群R3(主要为 Tc细胞),并分别对R2和R3中的细胞同时检测IFN-γ和IL-4的表达(图1)。每个标本收集R1内10000个细胞,结果均以 Th细胞或Tc中IFN-γ及IL-4表达的阳性百分率进行统计,并以同型对照抗体消除非特异性结合。

4.统计学处理

结 果

BD患者及正常人外周血 Th细胞和 Tc细胞细胞内IFN-γ及IL-4表达水平的检测:图1显示了采用流式细胞术检测正常人(右图)和BD患者(左图)外周血 Th和 Tc细胞细胞内 IL-4和IFN-γ表达水平的典型图。结果显示:BD患者活动期外周血细胞 Th细胞和 Tc细胞经过刺激后胞内合成 IFN-γ的水平明显高于正常人水平(Th细胞:22.45%±7.33%vs. 16.32 ±4.96%,P<0.05;Tc 细胞 :36.74% ±13.19%vs. 28.67% ±11.56%,P<0.05),稳定期患者(指皮损及症状完全消退,并全部停药)Th细胞和Tc细胞体外合成IFN-γ的能力与正常人相比无明显差异;稳定期患者 Th细胞和Tc细胞胞内合成IL-4的能力相对于正常人均无明显差异,但总体水平却略有上升趋势:(稳定期 Th细胞:3.01%±1.38%vs. 2.87%±1.46%, Tc细胞:1.14%±0.28%vs. 1.07% ±0.32%,P>0.05)。而活动期患者 Th细胞和 Tc细胞胞内合成IL-4的能力相对于正常人均存在明显差异:(Th细胞:3.54% ±1.62%vs. 2.87% ±1.46%,Tc细胞:1.82%±0.43%vs. 1.07%±0.32%, P<0.05)。

表1 BD患者及正常人外周血 Th细胞及 Tc细胞细胞内IFN-γ及IL-4表达水平Table 1 Percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD and normal individuals

图1 人外周血 Th和 Tc细胞细胞内 IFN-γ及 IL-4表达水平的代表图Fig.1 The expression of intracytoplasmic IFN-γ and IL-4 in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD

讨 论

BD是一种累及皮肤粘膜、眼、滑膜、血管、肠道、肺和神经系统等多系统的血管炎性疾患。目前BD的发病机制尚不清楚,但是越来越多的研究显示,免疫因素在疾病发病中起重要作用。本实验对有关BD的免疫学方面研究进行初步探讨。在实验中我们通过流式细胞术检测了BD患者外周血 Th和 Tc细胞内IFN-γ和 IL-4的表达水平,以此初步了解BD患者体内细胞免疫的状况。我们的实验结果表明,BD患者体内的确存在较严重的免疫功能的紊乱,主要表现在 CD8 T细胞比例上调导致CD4/CD8比值相对于正常人显著降低。说明BD患者体内 T细胞处于过度活化状态,且免疫效应细胞的比例也大大增加,打破了体内免疫平衡状态.

近年来,对BD患者进行了许多研究,报道了大量有关 Th细胞及 Tc细胞表达1型和2型细胞因子的结果。Th1型淋巴细胞产生被称作趋化因子的促炎症反应的调停者 ,如 IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α和 INF-γ百分比,它们在白塞病患者中均增高[1,4,5,]。这一发现被白塞病黏膜皮肤皮损趋化因子表达的分析所证实。将白塞病皮损与正常皮肤比较发现IL-8、单核细胞引诱物蛋白-1、IFN-γ和IL-12mRNA的表达大量增加,提示 Th1型淋巴细胞在白塞病的发病中起直接作用[6]。关于 Th2型淋巴细胞和细胞因子这一结果还存在争议。一些研究显示CD8+T淋巴细胞、IL-4和 IL-10的水平下降[2,7];而另外一些研究则显示CD8+T淋巴细胞总数和IL-4、IL-6、IL-10和 IL-13在血清中的浓度都是上升的[8,9,10],表明循环CD4+/CD8+的比率下降。实验研究发现CD4+/CD8+的比率与正常人相比明显下降,证实了上述第二种观点。随着对BD研究的深入和检测方法的改进,人们发现BD的免疫紊乱与疾病的临床表现、严重程度以及检测所用的方法密切相关。IFN-γ和 IL-4分别是具有代表性的1型和2型细胞因子,文献报道有关 IFN-γ在BD病人中的表达水平明显上调[1],而IL-4在BD病人中的表达水平,结果差异比较大,分别有上调和下降等说法[2,7,8,9]。进一步分析BD患者外周血CD4和CD8 T细胞胞内IFN-γ和IL-4的表达水平,了解患者体内 Th 1/Th2及 Tc1/Tc2的比例变化。研究结果表明,BD患者活动期外周血细胞 Th细胞和Tc细胞经过刺激后胞内合成 IFN-γ的水平明显高于正常人水平 (Th 细胞:22.45% ±7.33%vs.16.32 ±4.96%,P<0.05;Tc 细胞:36.74% ±13.19%vs. 28.67% ±11.56%,P<0.05),稳定期患者 Th细胞和 Tc细胞体外合成 IFN-γ的能力与正常人相比无明显差异;稳定期患者 Th细胞和Tc细胞胞内合成IL-4的能力相对于正常人均无明显差异,但总体水平却略有上升趋势:(稳定期 Th细胞:3.01% ±1.38%vs. 2.87% ±1.46%,Tc细胞:1.14% ±0.28%vs. 1.07% ±0.32%,P>0.05)。而活动期患者Th细胞和Tc细胞胞内合成IL-4的能力相对于正常人均存在明显差异:(Th细胞:3.54% ±1.62%vs. 2.87% ±1.46%,Tc 细胞:1.82% ±0.43%vs. 1.07% ±0.32%,P<0.05);因此,BD稳定期患者,与正常人相比外周血Th细胞和 Tc细胞表达1型和2型细胞因子的平衡无明显的偏倚。由于BD活跃期患者 Th细胞和 Tc细胞胞内合成 IFN-γ的能力明显增强,导致 Th细胞和Tc细胞有偏向 Th1及 Tc1的趋势(Th细胞IFN-γ/IL-4:6.34 ±3.24 vs. 5.69 ±4.72,P>0.05;Tc 细 胞 IFN-γ/IL-4:20.19 ±13.65 vs.26.79±14.52,P>0.05)。综上实验结果表明 ,BD患者外周血INF-γ和IL-4的表达水平明显升高,并与疾病活动期存在一定程度相关,可能对白塞病患者的诊断具有重要的临床意义。

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Relatiaonship between expression level of IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells and Behcet’s disease

Fan Chao,Zheng Jinfeng,Chen Hongxiang

(Fu Yong Hospital of S henzhen,S henzhen518103,China)

Objective To detect the percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD,and to study the immunological condition of the BD patient. Methods Flow cytometry was used to detect the percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with BD(active n=22,stable n=6)and normal individuals(n=22),respectively. Results The percentages of intracytoplasmic IFN-γ expression in patients with BD(active)was higher than those of normal individuals(Th cell:22.45% ±7.33%vs. 16.32±4.96%,P<0.05;Tc cell:36.74% ±13.19%vs. 28.67% ±11.56%,P<0.05),but they were insignificent between stable BD and normal controls.The percentages of intracytoplasmic IL-4 expression in patients with BD(active)was also higher(Th cell:3.54% ±1.62%vs. 2.87% ±1.46%,Tc cell:1.82% ±0.43%vs. 1.07% ±0.32%,P<0.05),but they were insignificent between stable BD and normal controls. (Th cell:3.01% ±1.38%vs. 2.87% ±1.46%,Tc cell:1.14% ±0.28%vs. 1.07% ±0.32%,P>0.05);so that Th and Tc cells deflect to Th1 and Tc1(Th cell IFN-γ/IL-4:6.34 ±3.24 vs. 5.69 ±4.72,p>0.05;Tc cell IFN-γ/IL-4:20.19 ±13.65 vs. 26.79 ±14.52,p>0.05). Conclusion The percentages of intracytoplasmic IFN-γand IL-4 expression in peripheral blood Th and Tc cells from patients with active BD is significantly increased,which may be significant in the diagnosis of BD.

Behcet’s disease; γ-interferon; Interleukin-4

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.005

2010-02-10

2010-04-01

深圳市宝安区科技计划项目(2008166)

樊超,男(1968年),汉族,医学博士。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)