正交试验法优选消渴降糖颗粒的提取工艺
2011-10-31李勇
李 勇
（广东药学院药物研究所/广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州510006）
正交试验法优选消渴降糖颗粒的提取工艺
李 勇
（广东药学院药物研究所/广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州510006）
目的优选消渴降糖颗粒的提取工艺。方法采用正交试验设计，以HPLC测定人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱含量、总固体得率为指标优选提取工艺条件。结果优选人参、黄连提取工艺为以70%乙醇6倍量、提取3次，每次1.5h。结论所优选工艺条件合理可行、稳定，为该药的开发奠定了基础。
消渴降糖颗粒；提取工艺；正交试验；人参；黄连
消渴降糖颗粒由人参、黄连、地黄等药物组成，具有益气养阴、清热润燥，养血活血作用，用于治疗属气阴两虚、瘀热互结之2型糖尿病。方中人参中含有皂苷类、人参多肽类等成分，具有明显调节机体糖代谢的作用[1-4]，与胰岛素合用，可减少胰岛素剂量，延长降血糖作用时间。黄连中含有小檗碱、甲基黄连碱等生物碱，实验证明小檗碱可降低正常小鼠、环氧嘧啶型糖尿病小鼠和自发性糖尿病小鼠的血糖，改善小鼠的葡萄糖耐受量、明显改善糖尿病患者的血液流变学作用[5,6]。原工艺以水提取，在制备和使用上有诸多不便，活性成分提取率较低。本文以人参皂苷Rg1含量、盐酸小檗碱含量为指标，采用正交试验设计，对人参、黄连的醇提工艺条件进行了优选。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Dionex ultimate 3000高效液相色谱仪（美国）；KQ-250型医用超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；LD4-2型离心机（北京医用离心机厂）；RE-52A旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）；AE-240S型电子分析天平（瑞士METTLER）；0～100（%VOL）酒精计（河北沧州双华仪表厂）。
1.2 试药
盐酸小檗碱（110713-200208）、人参皂苷Rg1（0703-200221），中国药品生物制品检定所提供；人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey的干燥根，黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎，以上药材均购自广州致信中药饮片有限公司，符合药典规定；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 人参、黄连单提、合提对比
2.1.1 人参、黄连单独提取样品溶液的制备
2.1.2 人参、黄连复方合提样品溶液的制备
称取人参30g、黄连20g，置圆底烧瓶中，加70%乙醇7倍量，加70%乙醇7倍量，加热回流2次，每次1.5h，提取液过200目滤布，合并滤液，定容至500mL，作为样品溶液Ⅲ，备用。
2.1.3 人参皂苷Rg1含量测定
2.1.3.1 色谱条件
色谱柱：DIONEX Acclaim 120 C18（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸（19.7∶80.3）；检测波长：203nm；柱温：30 ℃。
2.1.3.2 对照品溶液制备
精密称取人参皂苷Rg1对照品8.10mg，加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1 0.405mg的溶液，即得。
2.1.3.3 供试品溶液制备
精密吸取样品溶液Ⅰ、Ⅲ各50mL，水浴蒸干，残渣加水25mL使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为供试品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅱ。
2.1.3.4 标准曲线绘制
分别精密吸取2.1.3.2项下对照品溶液0.05、0.15、0.25、0.50、0.75、1.0mL，分别置于1mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，照上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），以人参皂苷Rg1微克数为横坐标（X），计算回归方程 Y＝5.9332X＋0.0192，r＝0.9999，表明人参皂苷Rg1在0.405～8.100μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。
2.1.3.5 含量测定
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液Ⅰ、Ⅱ各20 μL注入液相色谱仪中，测定人参皂苷Rg1色谱峰面积，计算其含量（表1）。
2.1.4 盐酸小檗碱的含量测定
2.1.4.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.1%十二烷基磺酸钠磷酸溶液（52∶48）；检测波长：265nm；柱温：30℃。
2.1.4.2 对照品溶液制备
精密称取盐酸小檗碱10.80 mg，加甲醇1mL含盐酸小檗碱0.1080mg的溶液，即得。
2.1.4.3 供试品溶液制备
精密吸取样品溶液Ⅱ、Ⅲ各1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别作为供试品溶液Ⅲ、供试品溶液Ⅳ。
2.1.4.4 含量测定
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液Ⅲ、Ⅳ各5μL注入液相色谱仪中，测定人参皂苷Rg1色谱峰面积，计算其含量（表1）。
2.1.4.5 标准曲线绘制
分别精密吸取2.1.4.2项下对照品溶液0.05、0.10、0.15、0.25、0.50、0.75mL，分别置于1mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，照上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），以盐酸小檗碱微克数为横坐标（X），计算回归方程 Y＝68.6700X－0.1329，r＝0.9999，表明盐酸小檗碱在0.108～1.62μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（表1）。
表1 人参、黄连单提与合提结果比较
由表1可知，人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱的相对提取率均高于人参，黄连单独提取，结合大生产，确定人参、黄连合提，并采用正交试验设计进一步对人参、黄连的提取工艺条件进行优选。
2.2 人参、黄连复方合提工艺研究[7,8]
2.2.1 正交实验设计
以人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱及总固体得率为指标，采用正交试验对影响提取效率的醇浓度、提取时间、溶剂用量、提取次数等因素进行优选，试验设计见表2。
表2 提取工艺因素水平表
2.2.2 数据分析
以人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱和总固体得率为指标考察四个因素，影响提取效率的因素依次为提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞加液量，较优的工艺方案为人参、黄连以70%乙醇6倍量回流提取3次，每次1.5h，结果见表3。
2.3.3 比较验证试验
因提取时间在第3个水平，故进行比较验证试验，称取人参30g，黄连20g，分别按表4条件进行提取，依法测定人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱及总固体得率，由表4可知，提取时间1.5h与2h，人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱均无明显差异，且各批样品指标成分均高于正交试验最大值，表明优选的工艺条件合理、可行、稳定。
3 讨 论
3.1 盐酸小檗碱易溶于热水和热乙醇，而在冷水、冷乙醇中溶解度降低，故在提取后需趁热抽滤，以减少成分损失。
3.2 在预实验中，人参、黄连分别以水和乙醇作为提取溶剂，以人参皂苷Rg1、盐酸小檗碱为指标考察，结果表明醇提效率较高，故选用乙醇回流提取。工艺中人参、黄连以乙醇合提，符合传统中医药理论，简化工艺，降低了成本，而且各药材都具有较高的提取效率，适合工业生产需要，验证试验结果表明本工艺合理可行。
表3 人参、黄连L9（34）正交试验及结果
表4 人参、黄连合提验证实验结果
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R282.710.2
B
1671-8194（2011）26-0219-03
