植物油脂多不饱和脂肪酸的分离与富集研究

吕 微,蒋剑春,徐俊明

（中国林业科学研究院林产化学工业研究所，生物质化学利用国家工程实验室，国家林业局林产化学工程重点开放性实验室，江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京 210042）

植物油脂多不饱和脂肪酸的分离与富集研究

吕 微,蒋剑春*,徐俊明

（中国林业科学研究院林产化学工业研究所，生物质化学利用国家工程实验室，国家林业局林产化学工程重点开放性实验室，江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京 210042）

利用低温冷冻结晶和尿素包合法在同一工艺条件下考察了五种植物油脂中多不饱和脂肪酸的分离和富集效果。低温冷冻结晶初步分离得到的脂肪酸Ⅰ中，仅含少量饱和脂肪酸，总不饱和脂肪酸含量达到95%以上，达到PUFAs的预浓缩目的。尿素包合法富集PUFAs实验中，光皮油、棕榈油脂中PUFAs的分离效果最好，亚油酸纯度达到96.67%和97.18%；小桐子油和大豆油脂中亚油酸含量分别为81.74%和91.75%；桐油中PUFAs的富集效果不明显，总PUFAs纯度仅由原来的85.36%提高到91.62%。

小桐子油，光皮油，桐油，棕榈油，大豆油，PUFAs，分离，尿素包合法

多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）是人体必需的营养物质，具有重要的生理功能[1]，能够促进身体发育和智力增长[2-3]、调节血脂、降低血中胆固醇和甘油三酯、改善血液微循环、提高免疫力，以及抗癌、抗肿瘤、预防心血管疾病等[4]；对风湿性关节炎、胃炎等的恢复保健也有功效[5]；在延缓衰老、减肥、美容等方面也有重要的生理作用[6]。因此，其潜在的医用药用价值受到了广泛的关注，引起了医药、化妆品甚至食品等行业的高度重视。资源丰富的生物柴油原料——小桐子油、光皮油、桐油脂中含有大量的PUFAs[7-9]，小桐子油、光皮油中脂肪酸成分与食用大豆油、菜籽油、棕榈油相似，具有生物活性的油酸、亚油酸含量很高[10]，桐油中三价PUFAs的含量高达85%[11]。将其中的PUFAs进行分离并富集为高纯度PUFAs，则可以作为特定的药物进一步研究开发并应用，具有重要的研究及应用价值。本文通过对小桐子油、光皮油、桐油和棕榈油四种工业级油脂和大豆油脂肪酸进行冷冻结晶和尿素包合法分离PUFAs，并对冷冻结晶和尿素包合法[12－13]分离过程中的脂肪酸进行GC－MS组成和含量分析，比较冷冻结晶和尿素包合法对五种植物油脂不饱和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acids，UFAs）的分离效果，为提高工业油脂PUFAs分离效果及高附加值开发利用提供技术支持和产品支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小桐子油、桐油、棕榈油、光皮油 工业级用油，来自江苏强林生物质能源有限公司；大豆油 产自益江粮油工业有限公司；尿素、乙醇、甲醇、氯仿、硫代硫酸钠、异丙醚、碘化钾、冰醋酸、一氯化碘等试剂

均为国产分析纯；四甲基氢氧化铵（25%水溶液）。

RE－52C旋转蒸发器、DF－101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；SH 2－Ⅲ循环水真空泵 南京科尔仪器设备有限公司；KHG－9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；夏普（SHARP）冰箱（型号SJ－187） 杭州玛迪科技有限公司；Agilent GC－MS联用仪 色谱型号Agilent technologies 6890N Network GC system，质谱型号Agilent 5973 Network Mass Selective Detector，进样器型号7683 Series Injector，美国Agilent公司。

1.2 油脂游离脂肪酸的制备

将7.4g NaOH溶于25m L蒸馏水后与50m L乙醇一起转入三口烧瓶，油脂从分液漏斗恒速滴加到三口烧瓶，机械搅拌均匀，70℃下滴加反应1.5h，保温2h，冷却到室温后滴加盐酸至pH 3～4，室温下继续保温1h后，静置分层，下层为粗甘油相，上层为粗脂肪酸，上层水洗（50m L蒸馏水）1次，旋转蒸发去溶剂乙醇得粗脂肪酸。

1.3 UFAS的分离、尿素包合法分离PUFAs

1.3.1 低温冷冻结晶分离饱和脂肪酸（Saturated Fatty Acids，SFAs）和UFAs 取粗脂肪酸20g与甲醇60g（质量比1∶3）混合密封于0.5℃下预冷,－20℃下冷冻2h；冷冻条件下过滤，得澄清滤液，旋转蒸发得脂肪酸Ⅰ；待滤饼溶解后旋转蒸发脱除甲醇,得脂肪酸I0。

1.3.2 尿素包合法分离PUFAs 将脂肪酸Ⅰ、尿素、甲醇按比例（质量比1∶1∶4）放入圆底烧瓶，55℃下搅拌加热至混合溶解；冷却后密封于0.5℃下预冷，－20℃下冷冻2h；冷冻条件下过滤，旋转蒸发滤液后，加入30m L异丙醚溶解脂肪酸，过滤出剩余尿素，将滤液旋转蒸发得脂肪酸Ⅱ；滤饼为包合固相物。

1.4 脂肪酸成分和含量分析

脂肪酸甲酯化方法及气－质联用法参照文献[14]。Agilent GC－MS联用仪，气相色谱条件：HP－5毛细管柱（30m×0.32mm×0.5μm）；进样温度250℃；检测器温度250℃；以氮气为载气；升温程序为100℃，保持2m in后，以5℃/m in升到250℃，然后保持5m in；进样量1μL。质谱条件：70eV电子能量：灯丝发射电流200μA；离子源温度200℃；接口温度250℃。成分鉴定主要依据质谱数据库NIST02进行自动比对完成，根据数据库所提供的脂肪酸的相对丰度计算出各脂肪酸的相对含量。

1.5 脂肪酸得率及收率计算

式中：Y1—脂肪酸Ⅰ的得率，%；m0—粗脂肪酸质量，g；m1—脂肪酸Ⅰ的质量，g；Y2—脂肪酸Ⅱ得率，%；m2—脂肪酸Ⅱ的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 植物油脂粗脂肪酸组成及含量

五种油脂肪酸经甲酯化处理及GC－MS检测后，鉴定出9～13种脂肪酸甲酯，并经面积归一化法确定它们的含量，每种油脂脂肪酸中前9种的出峰时间基本一致，所含成分基本相同。但大豆油、棕榈油、光皮油和小桐子油四种油脂中脂肪酸成分可归为硬脂酸、软脂酸、亚油酸、油酸四种；桐油中脂肪酸主要成分与其他四种相差较大，油酸含量较低，成分可归为软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸（α－亚麻酸9,12,15－十八碳三烯酸及γ－亚麻酸6,9,12－十八碳三烯酸），见表1。由表1可见，五种油脂中总PUFAs含量次序为桐油＞大豆油＞棕榈油＞光皮油＞小桐子油。通过对五种植物油脂脂肪酸组分和含量的GC－MS分析，为PUFAS分离和富集过程中各组分、组分含量变化和分离效果的提供参照和比较。

表1 不同植物油脂脂肪酸组成及含量

2.2 低温冷冻结晶分离不同植物油脂中UFAs

经低温冷冻结晶后所获得的五种植物油脂脂肪酸Ⅰ的组成和含量如图1所示。硬脂酸（除桐油的剩下少量未被除去外）已经被全部分离，只剩下少量的软脂酸留在脂肪酸Ⅰ中。总UFAs（油酸、亚油酸、亚麻酸）含量达到95%以上，说明一次低温冷冻结晶后，基本达到预浓缩UFAs、减轻尿素包合分离PUFAs负担的目的。但从亚油酸、亚麻酸的含量看，提高较少，所以总PUFAs含量仍不高。结合表2的脂肪酸Ⅰ得率和UFAs含量看，五种油脂中脂肪酸Ⅰ得率都不高，为35%左右。原因是实验中甲醇∶脂肪酸用量比（3∶1，g/g）偏小，所加入3份的甲醇量不足以溶解一份的脂肪酸，使得部分待溶解的UFAs未溶解，冷冻时以固体形式与晶体一同留在滤纸上。因此，在冷冻结晶分离UFAs时应增大甲醇∶脂肪酸用量比，提高脂肪酸Ⅰ得率，降低亚油酸和亚麻酸在脂肪酸Ⅰ中的损失。但是，如果甲醇用量过多，就未能形成饱和甲醇－脂肪酸溶液，虽然使UFAs得率增大，且总UFAs含量也会降低，后期尿素包合法分离PUFAs的负担增大。

图1 不同植物油脂脂肪酸Ⅰ的组成及含量

2.3 尿素包合法富集植物油脂PUFAs

尿素包合后所得脂肪酸Ⅱ中组成与含量如图2所示，尿素包合后软脂酸、桐油脂肪酸中的硬脂酸被全部除去，油酸也被大量分离，亚油酸和亚麻酸含量大幅上升，总纯度均达到91.5%以上（除小桐子油脂PUFAs纯度81.2%外）。对于光皮油和棕榈油，亚油酸含量在97%左右，纯度已经很高，所用尿素的量已基本能将单UFAs包合。但从表2来看，其脂肪酸Ⅱ的得率相对较低，因此，可通过适当增加甲醇用量提高脂肪酸Ⅱ得率。大豆油和小桐子油脂中PUFAs分离效果一般，纯度还有一定的提升空间，可通过增加尿素用量来提高亚油酸纯度。由于桐油脂肪酸成分和含量与其它四种油脂脂肪酸相差较大，出现其总PUFAs含量与其它PUFAs的含量提高程度相差很大，整个分离过程中亚油酸和亚麻酸的纯度仅提高了6.277%，原因是对于桐油PUFAs，甲醇用量未能将脂肪酸完全溶解，影响尿素的包合能力，未能溶解在甲醇中的PUFAs在低温－20℃下以固相形式与尿素包合物一起留在滤纸上。可见，对桐油PUFAs的分离既要增加尿素用量来提高纯度，又需加大甲醇用量来提高得率。

图2 不同植物油脂脂肪酸Ⅱ的组成及含量

2.4 植物油脂PUFAs分离及富集过程分析

从表2的酸值来看，酸值均较高，说明各个阶段所得的脂肪酸杂质极少，纯度都很高，且从粗脂肪酸开始，整个分离过程酸值基本不变。表2中碘值的变化与图1～图3中GC含量及含量的变化一致，即每种油脂脂肪酸的碘值的高低都与粗脂肪、脂肪酸Ⅰ和脂肪酸Ⅱ中总UFAs和PUFAs含量的高低对应。从图3的粗脂肪酸、脂肪酸Ⅰ和脂肪酸Ⅱ的总UFAs和PUFAs纯度看，这五种植物油脂PUFAs分离和富集过程中，除桐油外的四种组成相同的油脂PUFAs经冷冻结晶和尿素包合法分离富集后纯度的上升程度基本相同：小桐子油（39.58%）、大豆油（33.47%）、棕榈油（40.37%）及光皮油（41.36%）。经过尿素包合后总UFAs和PUFAs的纯度提升情况也基本一致：小桐子油（29.14%）、大豆油（26.04%）、棕榈油（28.84%）及光皮油（30.50%）。虽然桐油粗脂肪酸中亚油酸和亚麻酸含量很高，但在整个分离过程中总UFAs和PUFAs纯度提高不明显。

表2 五种植物油脂PUFAs分离和富集实验结果

从表2的脂肪酸Ⅰ得率看，油脂中脂肪酸Ⅰ得率较低，都在35%左右，桐油的更低（24.41%）。原因是由于每种油脂脂肪酸成分（特别是桐油）及含量的差异造成甲醇对每种油脂脂肪酸溶解能力的不同，形成甲醇－脂肪酸溶液的饱和程度也不同。低温冷冻结晶实验中甲醇∶脂肪酸用量比（3∶1，g/g）都偏小，使得部分待溶解的UFAs未溶解，导致脂肪酸中未溶解的UFAs在－20℃下凝固，在过滤时与晶体一同留在滤纸上。因此，在冷冻结晶分离UFAs时应增大甲醇∶脂肪酸用量比（尤其是对桐油脂肪酸的分离），提高脂肪酸Ⅰ得率，使亚油酸和亚麻酸的损失尽可能低。但是，如果甲醇用量过多，就未能形成饱和甲醇－脂肪酸溶液，虽然脂肪酸Ⅰ得率增大，但总UFAs和PUFAs含量却会相应降低，后期尿素包和法分离PUFAs的负担增大。

尿素包合法富集PUFAs过程中，尿素用量影响着PUFAs含量和脂肪酸Ⅱ得率的高低；甲醇用量既影响着脂肪酸、尿素的溶解和包合情况，又影响着脂肪酸Ⅱ的得率。从表2和图1～图3得到：小桐子油和大豆油脂中脂肪酸Ⅱ得率相对较高，总PUFAs纯度还有待提高，应增加尿素的用量；而光皮油、棕榈油脂中PUFAs的纯度已经很高，再增加尿素用量虽然能使纯度有小范围的提高，但脂肪酸Ⅱ得率会更低，在确保高纯度条件下可考虑增加甲醇用量来提高得率。对于本身PUFAs含量就很高的桐油，在该条件下尿素包和法富集效果不明显，从实验结果上看既需要增加尿素用量提高亚油酸和亚麻酸的含量，又要增加甲醇用量，溶解更多的尿素和脂肪酸，提高总PUFAs纯度和脂肪酸Ⅱ。

图3 不同植物油PUFAs分离过程中UFAs和PUFAs含量注：1，粗脂肪酸；2，脂肪酸I；3，脂肪酸II；a，小桐子油；b，大豆油；c，棕榈油；d，光皮油；e，桐油。

3 结论

3.1 五种油脂中PUFAs含量次序为桐油＞大豆油＞棕榈油＞光皮油＞小桐子油。大豆油、棕榈油、光皮油和小桐子油四种油脂中脂肪酸成分相同，主要成分均为亚油酸和油酸；桐油中脂肪酸主要成分是亚油酸和亚麻酸。

3.2 低温冷冻结晶分离SFAs和UFAs，脂肪酸Ⅰ中只含少量SFAs，达到了预浓缩PUFAs目的。可通过增加甲醇用量，提高脂肪酸Ⅰ得率并减少亚麻酸和亚油酸的损失。3.3 尿素包合法分离PUFAs中，光皮油、棕榈油脂中PUFAs的富集效果最好，亚油酸纯度达到96.67%和97.18%，可适当增大甲醇用量，以达到提高脂肪酸Ⅱ得率的目的；小桐子油和大豆油脂中亚油酸纯度分别为81.74%和91.75%，有必要同时增加尿素和甲醇用量以提高脂肪酸Ⅱ得率和总PUFAs含量；桐油中PUFAs的富集效果不明显，总PUFAs含量仅由原来的85.36%提高到91.62%，也要通过增加尿素和甲醇用量以提高脂肪酸Ⅱ得率以及亚油酸和亚麻酸的纯度。

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Separation and enrichment of polyunsaturated fatty acids in different vegetable fat

LV Wei,JIANG Jian-chun*,XU Jun-ming

（Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF，Keyand Open Lab.on Forest Chemical Engineering，SFA，Key Lab.of Biomass Energy and Materizal，Nanjing210042，China）

The separating and purifying effect of polyunsaturated fatty acids(PUFAs)in different vegetable fat were studied using lower temperature crystallization and urea adduction fractionation under the same technological conditions.Saturated fatty acid and unsaturated fatty acids(UFAS)were isolated by lower temperature crystallization.A little bit of saturated fatty acid and over 95%UFAs was detected in fatty acid Ⅰ obtained from the experiment of lower temperature crystallization，indicating that PUFAs was preconcentrated.For the enrichment of PUFAs using urea adduction fractionation，the best separation effect were displayed when PUFAs derived from palm oil and cornus wilsoniana seed oil were isolated，purities of linoleic acid were 97.18%and 96.67%.The contents of linoleic acid in Jatropha curcas L.seed oil and soybean oil were 81.74%and 91.75%.Unconspicuous effect of PUFAs in tung oil separation was depicted with the purity of total PUFAs increase from 85.36%to 91.62%.

Jatropha curcas L.seed oil； cornus wilsoniana seed oil； tung oil； palm oil； soybean oil； polyunsaturated fatty acid；separation；urea adduction fractionation

TS221

B

1002-0306（2011）10-0281-04

2010－11－08 * 通讯联系人

吕微（1984-），女，硕士，从事生物质能源转化利用研究。

国家“863”计划（2010AA101602）；国家林业局公益性行业专项经费（201104046）；国家自然基金（30700634）；江苏省基金（BK2009545）。