环氧氯丙烷交联淀粉的制备及其体外消化性能的研究

闵玉涛，宋彦显，马凤青，马庆一，*

(1.中州大学，河南郑州450044;2.郑州轻工业学院，河南郑州 450002)

环氧氯丙烷交联淀粉的制备及其体外消化性能的研究

闵玉涛1，宋彦显1，马凤青2，马庆一2，*

(1.中州大学，河南郑州450044;2.郑州轻工业学院，河南郑州 450002)

以环氧氯丙烷为交联剂，制备土豆交联淀粉。用正交实验考察环氧氯丙烷用量、氢氧化钠用量、反应温度和反应时间四个因素对交联度的影响，确定最佳工艺条件，并对体外消化条件进行优化，对不同交联度淀粉的消化速度进行研究。体外淀粉消化条件的优化实验显示，消化产物测定的最佳条件为:波长485nm，显色温度100℃，显色时间30min，葡萄糖浓度范围0～80μg/mL，其回归方程为y=0.0044x－0.005，R2=0.9988，且样品溶液在2h内显色稳定。各因素对交联淀粉制备影响的重要性依次为环氧氯丙烷用量、氢氧化钠用量、温度及反应时间;最佳工艺条件为:以50g土豆淀粉计，环氧氯丙烷用量为1.00mL，氢氧化钠用量为0.75g，温度50℃，时间6h，土豆交联淀粉和交联前相比，消化性降低了13.7%～34.5%，且与交联度呈负相关。

环氧氯丙烷，交联淀粉，体外消化

糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的，以高血糖为主要标志的临床综合症。近年来糖尿病发病率呈逐年上升趋势，根据糖尿病对胰岛素的依赖与否，可分为Ⅰ型(胰岛素依赖型)和Ⅱ型(非胰岛素依赖型)，糖尿病患者中约90%左右为Ⅱ型，其主要症状为餐后高血糖。体内淀粉等碳水化合物在α－淀粉酶催化作用下转化为糊精和麦芽糖。后者进一步水解为葡萄糖，经小肠吸收进入血液，可导致餐后血糖上升。餐后高血糖引起的并发症是糖尿病患者死亡的重要原因之一。抗性淀粉(RS)是一种新型的低热量功能性食品基料，它不能被小肠中的淀粉酶类水解，因而可延缓餐后血糖升高，其物理特性与普通淀粉基本相同，不影响食品的质构及口感［1］。同时，抗性淀粉是一种双歧杆菌增殖因子，并有减肥等其他生理功能。美国专利(US2006025381A1)宣称它可以调节和控制餐后血糖［2］。目前国内外对于RS4(化学改性淀粉)的相关研究主要集中在通过变性来提高淀粉的加工使用特性(如增强粘度、抗剪切力等)方面，在糖尿病治疗方面的应用研究鲜有报道。本文以环氧氯丙烷为交联剂制备土豆交联淀粉，通过体外消化模型研究其降糖活性，为新型降糖因子的研究与开发提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土豆淀粉 郑州毛庄农产品批发市场;MD31(500)即用型透析袋 上海基星生物科技有限公司;猪胰α－淀粉酶 实验室自制;其他所用试剂 均为化学分析纯。

721紫外可见分光光度计 上海第三分析仪器厂;HH－4数显恒温水浴锅 苏州威尔实验用品有限公司;800B台式离心机 长沙英泰仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 体外淀粉消化条件的优化

1.2.1.1 供试样品溶液的制备 1%的淀粉糊，煮10m in，冷却至35℃左右，取1m L放入透析袋中，加入0.5m L的α－淀粉酶，置pH6.9的PBS缓冲液中，37℃透析3h，取渗析液，稀释至适当浓度，即为样品溶液。

1.2.1.2 检测波长的选择 取5%的样品溶液0.5m L，放入25m L比色管中，加苯酚液1m L，摇匀，并迅速垂直加入5m L浓硫酸，再次摇匀，室温放置30m in，分光光度计进行波长扫描。

1.2.1.3 苯酚及硫酸用量的选择 取0.5m L样品液5份，分别加入苯酚液 0.5、0.6、0.8、1.0、1.2m L，加水至等体积，分别加入5m L浓硫酸，室温放置30min后，在485nm波长下测吸光度值。另取样品液0.5m L(5份)，分别加苯酚液1.0m L，再分别滴加浓硫酸2、3、4、5、6m L，并加水至等体积，以上述方法测吸光值。

1.2.1.4 检测波长的确定 在最佳的反应条件下进行二次扫描，确定最终检测波长［2］。

1.2.1.5 反应温度的选择 取0.5m L同一浓度的样品液9份，分别加入1.2.1.3所确定的苯酚及硫酸用量，置室温(25℃)、70、100℃各3份，保温 30m in后冷却5m in，485nm测吸光度值。

1.2.1.6 反应时间的选择 取样品液0.5m L，在优化反应条件下反应，每隔一定时间于485nm处测吸光度值，以达到吸光度值稳定的最短时间为最佳反应时间。

1.2.1.7 显色稳定性实验 在最佳反应条件下每间隔一定时间检测一次受试样品吸光度值，考察受试样品显色后的稳定性。

1.2.1.8 线性关系的考察及标准曲线的绘制 将系列浓度(0.5、1、5、8、10、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500mg/m L)的葡萄糖溶液，各取 0.5m L，以蒸馏水为空白对照，按上述方法显色检测，以糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线，再以直线部分做出标准曲线，并求出线性回归方程及相关系数。

1.2.2 土豆交联淀粉的制备

1.2.2.1 交联淀粉的制备 取一定量土豆淀粉，溶于碱液中，置于恒温水浴锅中，机械搅拌加热3～5m in后，将含有一定量的环氧氯丙烷的碱液滴加到淀粉乳中，中途不断搅拌，反应至规定时间。用稀盐酸调节pH至7.0，静置30m in后，3000 r/m in离心10m in，共4次，去除上清液，将底部沉积物转移到搪瓷盘中，置干燥箱中55℃干燥，研磨，即为交联淀粉。

1.2.2.2 沉降积的测定 称取0.500g交联淀粉，放入100m L的烧杯中，加蒸馏水稀释至2%，将烧杯置于82～85℃水浴加热，稍加搅拌，保温2m in，取出冷却至室温。取10m L糊液置于带刻度的离心管中，4000 r/m in离心2m in，将上清液转入10m L量筒中，读值，计算沉降体积。沉降积计算公式为:S=10－V，式中:S为沉降积(m L)，V为上清液体积(m L)。

1.2.2.3 正交实验法筛选最佳工艺条件 取50g土豆淀粉，选用正交实验法，对环氧氯丙烷、氢氧化钠用量、反应温度、反应时间4个因素的3个水平进行筛选，以交联淀粉的沉降积作为主要考核指标。

表1 正交实验因素水平表

1.2.3 淀粉消化性能的研究 取0.5%淀粉溶液(已沸腾5m in)1m L于透析袋中，再加入0.5m L稀释好的α－淀粉酶，系口，放入37℃的缓冲溶液中透析3h。每30m in取透析液一次，每次0.5m L，分别置于6支试管中，以缓冲液为空白样。以上述1.2.1的方法测吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 淀粉体外消化产物测定条件

2.1.1 检测波长的选择 由图1可看出，最大吸收峰在485nm处。

图1 样品扫描色谱

2.1.2 苯酚及硫酸用量选择 由表2、表3可知，苯酚及硫酸用量分别选择0.6、4m L为宜。

表2 苯酚用量选择

2.1.3 检测波长的确定 苯酚及硫酸用量选择后的色谱与图1相比，发现最大吸收波长并没改变，仍为485nm，所以最终确认最大吸收波长为485nm，由于在最大波长处信噪比最大，灵敏度最高，所以选择检测波长在最大吸收波长。

2.1.4 反应温度及时间的选择 由表4可知，100℃下吸光度值最大，由表5可知，反应30m in后吸光度值基本稳定，因此反应温度选择100℃，反应时间定为30m in。

表4 不同反应温度下的吸光度

表5 不同反应时间下的吸光度

2.1.5 显色稳定性实验 由表6可知，2h内显色基本稳定。2.1.6 线性关系的考察及标准曲线的绘制 由图2和图3可看出，糖浓度在0～80μg/m L范围内线性关系良好，其回归方程为 y=0.0044x－0.005，R2=0.9988。

表6 不同时间的吸光度值

图2 浓度与吸光度之间的关系

图3 标准曲线

2.2 交联淀粉正交实验结果

2.2.1 正交实验的设计

2.2.1.1 环氧氯丙烷用量的选择 随着环氧氯丙烷用量增加，产品交联度增加。因此，选环氧氯丙烷用量0.25、0.65、1.00m L分别为正交实验的3个水平。

2.2.1.2 氢氧化钠用量的选择 氢氧化钠在交联反应中起到催化作用，其加入量关系到交联反应的好坏。如果氢氧化钠在反应中过量，乳液中会出现局部凝胶或糊化现象，既影响产品的质量又影响产率，致使反应不均匀［3］，过滤、洗涤也发生困难，最重要的是影响产品质量并且降低产率;若氢氧化钠用量不足，交联反应中所产生的盐酸会逐渐积累，后者会使环上的氧质子化，从而使对氧原子上亲核进攻引发的交联反应速度减慢，达不到所需的交联度。

2.2.1.3 反应温度和时间 选择适宜的反应温度和时间，是控制反应速度、确定生产周期的主要因素。较高的温度有利于交联反应的进行，但温度超过70℃，淀粉乳液会糊化［4］;一定条件下适当延长反应时间可提高产率，但时间过长不利于工业化生产;因此选择的反应温度和时间范围分别为25～70℃、2～10h。

2.2.1.4 氯化钠的作用 在交联反应中，淀粉乳在搅拌情况下，淀粉颗粒吸着碱极易膨胀，不易制出交联度较高的产品，在反应中加入一定量的中性无机盐，如无水氯化钠、硫酸钠，可抑制淀粉颗粒的膨胀，提高交联淀粉在使用过程中的稳定性［5］。

2.2.2 正交实验结果分析 对正交实验结果作极差分析，结果见表7。

表7 正交实验结果

从表7结果直观分析可知，由于沉降积越小，交联度越高，5号交联淀粉的交联度最高，其次是3、7号。

根据极差分析可知，在设定的水平范围内交联反应条件最佳组合为:A2B2C2D3，即以50g土豆淀粉计，氢氧化钠用量为 0.75g，环氧氯丙烷用量为1.00m L，反应时间为6h，反应温度为50℃。各因素对实验指标影响的重要性依次为环氧氯丙烷用量、氢氧化钠用量、反应温度及时间。按此工艺重复3次实验，测得的沉降积平均值为1.31m L，不仅与直接观察确定的5号实验沉降积同处一个水平，并且反应时间短。

2.3 淀粉消化性能的测定

根据线性回归方程 y=0.0044x－0.005，R2=0.9988，在体外模型系统中测定它们在不同消化时间的消化产物，计算得结果如图4所示。

图4 淀粉体外消化性能图

图4表明，土豆交联淀粉颗粒消化性能的变化趋势与原淀粉糊基本相同，随着消化时间的不断增加，消化产物量不断增大，平均消化速度不断减小，但其数值远远小于原淀粉糊的数值;高交联度的土豆淀粉的消化速度要明显慢于低交联度及原土豆淀粉，随交联度的增大，消化速度不断降低。随着消化时间的延长，土豆淀粉及微细化样品的消化产物不断增加，平均消化速度则不断减慢。这是因为α－淀粉酶是内切酶，能无规则地水解淀粉分子中的α－1，4葡萄糖甙键。在水解初期，淀粉糊中庞大的结构松散的分子很容易被切断成较小的分子，水解速度较快［6］。但随着淀粉链变短，酶作用底物的结合点也相应减少，且α－淀粉酶不能水解淀粉的α－1，6葡萄糖甙键，使水解速度迅速减慢［7］。

影响体外消化系统中淀粉颗粒消化速度的因素主要来自两方面:一是唾液α－淀粉酶与淀粉颗粒的酶促反应速度;另一原因是消化产物在渗析袋中的扩散和渗析速度。唾液α－淀粉酶与淀粉颗粒作用为固液两相反应，酶分子首先由液相扩散到淀粉颗粒表面，使酶活性中心与淀粉分子链的特定区域结合并定位;然后酶分子的催化部位再进行催化淀粉水解的作用。显然，由于变性处理而导致的淀粉分子结构和组成的变化会不可避免地影响酶促反应各步的进行，从而影响淀粉颗粒对淀粉酶作用的敏感性。当较低交联度时，交联键的分布极其稀疏即交联密度很小［8］。唾液α－淀粉酶是分子内切酶，它以无规则的方式深入淀粉分子链的内部对淀粉分子进行水解，所以较低交联度并不会阻碍唾液α－淀粉酶对淀粉分子的攻击。随着交联度的增加，交联的空间位阻逐渐体现出来，因而消化速度逐渐降低。此外这些淀粉样品的消化速度均随消化时间延长而降低，是因为可与唾液α－淀粉酶作用的合适分子链大小的淀粉分子不断减少的缘故。

3 结论

3.1 消化性能最佳测定条件:波长485nm，显色温度100℃，显色时间30m in，且其样品液在2h内显色稳定。

3.2 以葡萄糖作标准品，糖浓度在0～80μg/m L范围内线性关系良好，其回归方程为y=0.0044x－0.005，R2=0.9988。

3.3 交联反应最佳工艺为:以50g土豆淀粉计，氢氧化钠用量为0.75g，环氧氯丙烷用量为1.00m L，反应时间为6h，反应温度为50℃。各因素对实验指标影响的重要性依次为环氧氯丙烷用量、氢氧化钠用量、温度及反应时间。

3.4 原土豆淀粉经交联后其消化性降低13.7%～34.5%，且交联度与消化性呈负相关性，即交联度越高(沉降积越小)，消化性能越低。

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Study on preparation and digestibility in vitro of crosslinked starch by epichlorohydrin

MIN Yu－tao1，SONG Yan－xian1，MA Feng－qing2，MA Qing－yi2，*

(1.Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China;
2.Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

With epichlorohydrin as crosslinking agent，potato crosslinked starch was prepared.Influences of epichlorohydrin dosage，sodium hydroxide dosage，reaction temperature and reaction time were researched using orthogonal test，and optimum technological condition was determined.The digestibility was also studied.The results showed that the optimum determination condition of crosslinked starch was as follows:wavelength 485nm，temperature 100℃，time 30m in，glucose concentration 0～80μg/m L，regression equation was y=0.0044x－0.005，R2=0.9988，and the sample color was stable within 2h.The factors influencing order was epichlorohydrin dosage，sodium hydroxide dosage，reaction temperature and reaction time.The optimal preparation condition was as follows:50g potato starch as material，epichlorohydrin dosage 1.00m L，sodium hydroxide dosage 0.75g，temperature 50℃，time 6h.under the condition above，the digestibility of crosslinked starch decreased by 13.7%～34.5%than raw starch，negative correlation with crosslinking degree.

eplchlorhydrin;crosslinked starch;digestibility in vitro

TS236.9

B

1002－0306(2011)08－0261－04

2010－05－21 *通讯联系人

闵玉涛(1978－)，硕士，助教，研究方向:食品生物技术。