乳与乳制品中β-内酰胺酶的特性及检测方法

刘志楠，喻东威，赵源，刘晓川，赵雅丽，薛志清，李梅

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司质量管理系统分析检测中心，内蒙古011500）

乳与乳制品中β-内酰胺酶的特性及检测方法

刘志楠，喻东威，赵源，刘晓川，赵雅丽，薛志清，李梅

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司质量管理系统分析检测中心，内蒙古011500）

研究了β-内酰胺酶的特性和检测方法；向复原乳中添加不同浓度的青霉素钠，从而确定β-内酰胺酶降解抗生素的最适比例；通过耐热性试验和耐久性试验来确定其稳定性；通过添加青霉素钠来检测β-内酰胺酶的含量。结果表明：β-内酰胺酶降解抗生素的最适比例为3瓶/t；β-内酰胺酶经100℃沸水处理后（90 s）和经长时间保存后（4℃，96 h）仍具有很强的抗生素降解能力；添加10-9g/L青霉素钠，经37℃3 h静置反应后，添加的抗生素可被降解。了解β-内酰胺酶的特性后可以应用本方法检测乳与乳制品中β-内酰胺酶的比例。

β-内酰胺酶；青霉素钠；乳与乳制品。

0 引言

随着人们生活质量的逐渐提高，食用乳及乳制品的安全问题备受关注，而其中最突出的就是抗生素的残留[1-3]。目前，青霉素作为β-内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购，出于经济利益驱动，一些不法分子人为地使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司宣称出售分解牛乳中残留抗生素解抗剂。经过调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶[4]。β-内酰胺酶作为国家禁止的添加物，现行的检测方法主要有直接法和间接法[5]。本实验拟采用间接法[6，7]。

1 材料与方法

牛奶，青霉素钠磷酸盐缓冲液，无抗新西兰奶粉，β-lactamase，Twinsensor抗生素检测试纸条，chram抗生素检测试纸条，利普斯50抗生素检测试剂，水浴锅，培养箱。

向复原乳中添加不同浓度的青霉素钠，从而确定β-内酰胺酶降解抗生素的最适比例；通过耐热性试验和耐久性试验来确定其稳定性；通过添加青霉素钠来检测乳与乳制品中β-内酰胺酶的比例。

2 结果

2.1 比例实验

2.1.1 含有10-8g/L青霉素钠的牛乳

新西兰无抗奶粉10 g+90 mL蒸馏水，振荡混均制成复原乳，990 μL复原乳+10 μL的β-lactamase配置形成β-lactamase母液。另10 mL或5 mL复原乳加100 μL青霉素钠的量为1×10-6，配置形成抗生素为10×10-8或5×10-9的溶液5份，分别添加2，6，18，30 μL的β-lactamase母液到10 mL复原乳中，其β-lactamase最终比例为1瓶/3t、1瓶/t、3瓶/t和5瓶/t牛奶、混均，37℃静置3 h，Twinsensor检测，结果如表1所示。

表1 含有10-8g/L青霉素钠的牛乳Twinsensor检测结果

2.1.2 含有5×10-9g/L青霉素钠的牛乳

新西兰无抗奶粉10 g+90 mL蒸馏水，振荡混均制成复原乳，990 μL复原乳+10 μL的β-lactamase配置形成β-lactamase母液。另5 mL复原乳加100 μL青霉素钠的量为1×10-6，配置形成抗生素的量为5×10-9的溶液5份，分别添加2，6，18，30 μL的β-lactamase母液到10 mL复原乳中，其β-lactamase最终比例为1瓶/3t，1瓶/t，3瓶/t和5瓶/t牛奶、混均，37℃静置3 h，Twinsensor检测，结果如表2所示。

表2 含有5×10-9青霉素钠的牛乳Twinsensor检测结果

由表1和表2可以看出，在最佳反应条件下（37℃，3 h），含有5×10-9或10-8g/L青霉素钠的牛奶经不同比例β-lactmase处理后，1瓶/3 t或1瓶/t的β-lactmase比例不能彻底降解青霉素钠。考虑到奶站的实际，3～5瓶/t牛奶β-lactmase比例才可能降解牛奶中的抗生素。

2.2 Beta-lactamase的稳定性实验

2.2.1 β-lactamase的耐热性实验

采用100℃沸水处理。新西兰无抗奶粉10 g+90 mL蒸馏水，振荡混均制成复原乳，990 μL复原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液，添加18 μL的βlactamase母液到10 mL复原乳中，其β-lactamase最终比例为3瓶/t牛奶，取上述牛奶6份均为1 mL，分别煮沸0，10，30，60，90，120 s后迅速降温到室温，热处理后的6瓶×1mL复原乳分别加入10 μL的1×10-6g/L青霉素钠，另取1 mL无β-lactamase的复原乳加入10 mL的1×10-6g/L青霉素钠作为对照（抗生素的量为10-8），混均，37℃静置3 h；分别用Twinsensor，E50，Charm检测，结果如表3所示。

表3 β-lactamase的耐热性实验检测结果

2.2.2 β-lactamase的耐久性实验

新西兰无抗奶粉10 g+90 mL蒸馏水，振荡混均制成复原乳，990 μL复原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液，分别添加0，6，18，30 μL的β-lactamase母液，到10 mL复原乳中，其β-lactamase最终比例为0瓶/t，1瓶/t，3瓶/t和5瓶/t牛奶、混均；37℃静置3 h后4℃保存96 h，分别取上述1 mL复原乳+10 μL的1×10-6g/L青霉素钠（抗生素的量为10-8），混均，37℃静置3 h，分别用Twinsensor、E50和Charm检测,结果如表4所示。

表4 β-lactamase的耐久性实验检测结果

由表3和表4可以看出，经100℃沸水处理后（90 s），牛奶中的β-lactmase仍具有很强的β-内酰胺类抗生素降解能力。牛奶中的β-lactmase经长时间保存后（4℃，96 h）仍具有很强的β-内酰胺类抗生素降解能力。经上述实验证明，牛奶中添加的β-lactmase具有稳定的降解β-内酰胺类抗生素的能力（为添加抗生素方法检测解抗剂存在提供理论基础）。

2.3 抗生素解抗剂检测方法

2.3.1 10-9青霉素钠添加检测

无抗新西兰奶粉10 g+90 mL蒸馏水，振荡混均制成复原乳，990 μL复原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液；（10 mL复原乳+100 μL,1×10-6g/L青霉素钠）×2（抗生素的量为10-8），分别添加18 μL和30 μL的β-lactamase母液到10 mL复原乳中，其β-lactamase最终比例为3瓶/t和5瓶/t牛奶，混均，室温静置3h，Twinsensor检测结果（-）。其中一部分进行以下操作：2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），沸水处理120 s后降至室温，上述处理的（1 mL复原乳+10 μL10-6g/L青霉素钠）×4（抗生素的量为），两种比例的样品分别37℃和室温静置，3 h后Twinsensor和Charm检测；另一部分进行以下操作：2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），上述处理的（1 mL复原乳+10μL 10-6g/L青霉素钠）×4（抗生素的量为10-8g/L），两种比例的样品分别37℃和室温静置，3 h后Twinsensor和Charm检测，结果如表5所示。

表5 10-8g/L青霉素钠添加3小时后检测结果检测

2.3.25 ×10-9g/L青霉素钠添加检测

无抗新西兰奶粉10 g+90 mL蒸馏水，振荡混均制成复原乳，990 μL复原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液；（10 mL复原乳+50 μL,1×10-6g/L青霉素钠）×3（抗生素为5×10-9g/L），分别添加6，18，30 μL的β-lactamase母液到10 mL复原乳中，其β-lactamase最终比例为1瓶/t，3瓶/t和5瓶/t牛奶，混均，室温静置3 h，Twinsensor检测结果（-）。其中一部分进行以下操作：2瓶×1 mL（1瓶/t）、2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），沸水处理120 s后降至室温，上述处理的（1 mL复原乳+5μL，1×10-6g/L青霉素钠）×6（抗生素的量为5×10-9g/L），两种比例的样品分别37℃和室温静置，3 h后Twinsensor和snap检测；另一部分进行以下操作：2瓶×1 mL（1瓶/t）、2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），上述处理的（1 mL复原乳+5 μL,1×10-6g/L青霉素钠）×6（抗生素的量为5×10-9g/L），两种比例的样品分别37℃和室温静置，3 h后Twinsensor和snap检测，结果如表6所示。

表6 5×10-9g/L青霉素钠添加3h后检测结果检测

由表5和表6可以看出，本研究模拟原奶中含有抗生素，并用合适量的解抗剂降解，3 h室温或37℃静置反应后，用微生物法（E50试剂盒）和快抗法（Twinsensor、Charm和Snap）检测均为抗生素阴性的情况下，再往这些牛奶中添加抗生素（青霉素钠），用微生物法（E50试剂盒）和快抗法（Twinsensor、Charm和Snap）来检测这些添加的抗生素的变化来推断原奶中是否含有解抗剂。

含有合适比例解抗剂的牛奶（3瓶/t）中，添加抗生素青霉素钠5×10-9或10-8g/L后，室温或37℃反应3 h，均可使添加的抗生素降解。37℃比室温反应的结果好。添加抗生素的量10-8相对较好，5×10-9接近目前公司各种检测试剂盒的极限，结果判断有些难度。经过热处理（120 s）的样品中解抗剂虽然活性降低，但仍能降解添加的抗生素（3 h，37℃），即使不能完全降解添加的抗生素，但通过阳性值明显降低也可以判断解抗剂的存在，这使得本方法检测成品中解抗剂有了可能。

2.4 β-lactamase的活力测定

精密量取青霉素溶液（每1 mL含有青霉素1万单位，pH值为7.0磷酸盐缓冲液）50 mL，预热37℃后，精密加入已预热好的青霉素酶稀释液（每1 mL含有青霉素酶8 000～12 000单位，pH值为7.0磷酸盐缓冲液，在37℃预热。）25 mL，迅速混匀，在37℃准确放置1h，精密量取3 mL，立即加入已精密量取的碘滴定液（浓度为0.005 mol/L）25 mL中,在室温暗处放置15 min，用硫代硫酸钠滴定液（浓度为0.01 mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴加至蓝色消失。

空白试验：取已预热的青霉素溶液2 mL，精密加入上述碘滴定液（浓度为0.005 mol/L）25 mL,然后精密加入青霉素酶稀释液1 mL，在室温暗处放置15 min，用硫代硫酸钠滴定液（浓度为0.01mol/L）滴定。按照公式计算。测定结果为

E=(B-A)MFD100=(21.43-0.1)×0.01×742×300×100=474.8万U/mL，

式中：E为青霉素酶活力；B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的体积；A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的体积；M为硫代硫酸钠滴定液的浓度；F为在相同条件下，每1 mL的上述碘滴定液（浓度为0.005 mol/L）相当于青霉素的效价；D为青霉素酶溶液的稀释倍数。

3 讨论

牛奶中的解抗剂β-lactamase保存期长，耐热性和稳定性好。3-5瓶/t的比例解抗剂β-lactamase在室温3 h可以完全中和或降解牛奶中的抗生素。含有抗生素和合适量解抗剂β-lactamase的牛奶，再添加10-9g/L抗生素青霉素钠后，经37℃（3 h）静置反应后，添加的抗生素可被降解，与对照比较，添加的抗生素被降解，可间接证明解抗剂的存在。本法同时检测抗生素和抗生素解抗剂。本法检测解抗剂的限度目前为0.018 g/L牛奶，0.01 g/L牛奶以下也可检出。本法无需购买新仪器。只要无抗新西兰奶粉或无抗奶和廉价的青霉素钠，可操作性强，结果判断简单。

[1] 何金环，王一凡.TTC和ELISA法检测纯牛奶中抗菌药物残留比较[J].安徽农业科学，2007，35（9）：2576-2577.

[2] 买合木提·克衣木,宋迎春,买热木尼沙·吾甫尔.无公害牛奶安全生产探析[J].现代农业科技，2009（3）：239-240.

[3] 梁勇，李巧苏.关于动物源食品安全性的思考[J].现代农业科技，2008（17）：295-296.

[4] 魏国美.杯碟法测定乳与乳制品中β-内酰胺酶[J].福建分析测试，2010，19（3），57-59.

[5] 喻东威.一种检测乳中抗生素和/或抗生素拮抗剂的方法:中国,CN101403733A[P].2009-04-08.

[6] MORGAN J F,CAMPBELL M.A rapid method for the production and isolation of penicillinase[J].Bact,1947,6:337-343.

[7] WILLIAMS D H,BONDI A,MOAT A G,et al.Thermostabihity of Bacillus cereus penicillinase[J].Bact,1966,91(1):257-261.

β-lactamase character and detected method in milk and milk product

LIU Zhi-nan，YU Dong-wei，ZHAO Yuan，LIU Xiao-chuan，ZHAO Ya-li，XUE Zhi-qing，LI Mei
（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry(Group)Limited Company Quality Management Department Analysis Test Center，Inner Mongolia 011500，China）

Sstudy on the character and detecting method of β-lactamase can degrade the antibioticr.Added different concentration benzylpenicillin sodium into in this experiment,to sure the optimal proportion of antibiotic degraded by the β-lactamase and determine the stability by the heat resistance and durability experiment;detected the content of β-lactamase by adding benzylpenicillin sodium.Results:The optimal βlactamase ratio for degrading antibiotics was 3 bottles/t,It still keep strong antibiotics degrading ability by dealt with 100℃water for 90 s or stored in 4℃，96 h;added 10ppb benzylpenicillin sodium which was degraded after set in 37℃3 h.Applied the method to detect β-lactamase content in milk or milk product after understanding the character of β-lactamase.

β-lactamase;benzylpenicillin sodium;milk and milk product

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0053-03

2010-10-14

刘志楠（1982-），男，分析研究员，研究方向为食品检测与分析。