GC-MS法测定奶与奶制品中雌二酮残留量的研究

刘勇军，刘创基，姜艳彬，吴银良，雷春娟

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京100125;2.宁波市农业科学院，浙江宁波315000）

GC-MS法测定奶与奶制品中雌二酮残留量的研究

刘勇军1，刘创基1，姜艳彬1，吴银良2，雷春娟1

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京100125;2.宁波市农业科学院，浙江宁波315000）

通过液液萃取和固相萃取提取、净化奶与奶制品中添加的雌酮，以TMS衍生化试剂BSTFA衍生化，气相色谱-质谱联用（选择离子模式，选择离子为m/z218、m/z244、m/z257、m/z342）对衍生物检测分析，确定了样品中雌酮的定性、定量分析方法，该法检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.8μg/kg。衍生物的峰面积与样品质量浓度在0.5～1000 μg/L范围内呈良好的线性关系，线性回归系数为0.999。雌酮不同加入量的添加回收率为70.1%～93.6%,变异系数为2.0%～3.7%。该方法可实现对样品进行灵敏、准确的定性定量分析。

固相萃取；气质联用；雌酮；选择离子监测

0 引言

雌酮（Estrone，ESN），又名α-卵泡激素、雌甾酮、雌酚酮和雌激素酮，雌酮是甾类同化激素(anabolic steroids,Ass)中一种重要的雌激素[1]，兽医临床用于同期发情和家畜促生长及提高饲料转化率。但长期摄入雌激素会导致女性化、性早熟，特别是雌激素类物质具有明显的致癌效应[1,2]。

雌酮的分析方法在有GC法[3]、酶联免疫法[4]、HPLC法[5,6]、放射免疫法[7]及HPLC-MS/MS法[8-12]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[13-16]等检测方法，但通过检索文献发现，对于奶与奶制品中雌激素检测的研究报道还很少，因此作者在前期制定了国家标准“奶及奶制品中17β－雌二醇、雌三醇、炔雌醇残留检测-GC/MS法”的基础上，采用固相萃取技术，对奶与奶制品中的雌酮进行提取、净化处理，利用SIM（选择离子监测模式）-GC-MS定性、定量分析。

1 实验

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：AgilentGC6890/5973NMS，配有EI源和自动进样器；MiniShaker涡旋振荡器；Supersicol固相萃取仪；旋转蒸发器；高速离心机;E-EVAP氮吹仪；奥立龙868pH计,MILLI-Q超纯水器，SartoriusBL310电子天平，固相萃取小柱：C18(500mg,3mL)。

以下所用试剂，除特别注明者外，均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的二级水。

主要试剂：雌酮标准品（纯度99.0%Sigma公司）；甲醇；乙酸铵；冰乙酸；乙腈（色谱纯）；乙酸乙酯；正己烷；甲苯；N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺BSTFA（美国Supelco Park公司）。

1.2 色谱条件

色谱柱:DB-1MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25 μm），载气流量：He，1.0 mL/min，温度梯度：色谱柱起始温度100℃(保持1 min)，以20℃/min的升温速率升至200℃（保持3 min），再以20℃/min的升温速率升至260℃（保持5 min），再以20℃/min的升温速率升至280℃（保持5 min）；无分流进样，进样量1.0 μL，溶剂延迟8 min；EI源，电离电压70 eV，进样口温度220℃，离子源温度200℃，四极杆温度160℃，选择离子监测模式（SIM）。

1.3 样品处理

1.3.1 样品中雌酮的提取

1.3.1.1 液态样品

量取试料10.0 mL于50 mL离心管中，加入乙腈5 mL和乙酸乙酯15 mL，旋涡振荡3 min，以7 800 r/min离心5 min，收集上清液于另一50 mL离心管中，然后在残渣中重复提取1次，合并上清液，40℃水浴中旋转浓缩至近干，用1 mol/L氢氧化钠溶液6 mL分3次溶解，转移至另一50 mL离心管中，加正己烷20 mL旋涡振荡1 min,以7 800 r/min离心3 min，收集下层提取液，提取液中加1 mL浓度为2.0 mol/L乙酸铵溶液，用冰乙酸调pH值5.0～5.2，备用。

1.3.1.2 固态样品

称取（5±0.05）g样品于50 mL离心管中，加入乙腈5 mL和乙酸乙酯20 mL，加1 mL去离子水，旋涡振荡3 min，以7 800 r/min离心5 min，收集上清液于另一50 mL离心管中，然后在残渣中加乙腈5 mL和乙酸乙酯20 mL重复提取1次，合并上清液，其他同液态样品处理。

1.3.2 固相萃取净化样品

将上述溶液转移到已依次用甲醇5 mL、水5 mL活化的C18小柱上，然后分别用水5 mL和5 mL 40%甲醇水（甲醇∶水=4∶6，体积比）淋洗，抽干，再用甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，在40℃水浴中用氮气吹干。

在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1 mL/min左右。

1.3.3 衍生化

将上述净化、吹干的试样至于60℃烘箱中干燥15 min，使试管内壁不存任何可视水分。取出冷却，加入100 μL甲苯和100 μL BSTFA试剂，盖紧塞子，在涡旋振荡器高速振荡1 min，置于80℃恒温加热器中衍生60 min。衍生后冷却至室温，用甲苯定容至0.5 mL，转移至2 mL进样瓶中，供气质联用色谱仪进样。同时用雌酮标准使用液作系列同步衍生。

1.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

精密称取100 mg雌酮对照品置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，作为雌酮储备液。精密量取雌酮储备液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为雌酮工作液。分别准确吸取一定量的标准工作液，用甲醇稀释、定容，配制成浓度为0.5～1000 μg/L标准溶液系列，各浓度标准溶液分别用100 μL的BSTFA衍生化试剂，按上述衍生化步骤衍生和气质分析。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱-质谱分析

取浓度为10 mg/L雌酮用BSTFA衍生生成三甲基硅烷衍生物，进行GC-MS全扫描（MS为scan模式，碎片离子扫描范围为50～600）其scan分析模式质谱图如图1所示。从全扫描质谱可知，雌酮在BSTFA衍生化下进行GC-MS全扫描分析，能产生m/z192、m/z218、m/z232、m/z244、m/z 257、m/z285、m/z327、m/z342等系列特征碎片离子，根据质谱SIM模式的要求，分析物质产生的碎片离子应选择专属性强、丰度较高、基线本底低、受外源组分干扰少、空白样品不产生所选择的特征碎片或产生信号特别低。通过试验发现，m/z 327虽然特征性强，丰度也较高，但在空白样品中也检测到存在有较强的m/z 327离子峰，且在添加样品检测中发现m/z 327的本底较高，故特征碎片离子m/z327不予选择，而特征碎片离子m/z192和m/z232由于丰度太低，也不适合作为SIM模式的选择性特征离子，所以本方法选择m/z218、m/z244、m/z257和m/z342作为雌酮的选择监测特征离子。

图1 标准样品中雌酮的质谱图

2.2 衍生化条件的选择

雌酮结构（见图2）中含有羟基、酮基和芳环，侧链C3、C17为极性基团，低挥发性，因此不适合直接进行GC/MS分析。常用的解决办法就是将其C3羟基和C17酮基衍生化(硅烷化、酰化和烷基化)为醚类。

实验中选用了七氟丁酸酐(HFBA)、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)和MSTFA-TMIS-DTE四种衍生化试剂进行比较。结果表明，MSTFA-TMISDTE较其它衍生三种衍生效果差一些，效率最高的为BSTFA衍生试剂，能得到较强的分子离子峰。所以本方法采用BSTFA作为衍生化试剂。由于衍生化试剂遇水立即分解且衍生物遇水也容易分解，因此在衍生化操作中应特别注意避免接触水。

图2 雌酮分子结构

2.3 回归方程、线性范围及检出限

配制雌二醇质量浓度分别为0.5，5，10，50，100，500，1 000 μg/L系列标准溶液，按照本方法进行衍生测定。测定得出雌二醇浓度与峰面积在0.5～1 000 μg/L范围839.内呈现良好线性关系；以y表示峰面积A，x表示组分质量浓度C（μg/L），求得回归方程为y=3.25×102x+3.27×103，相关系数R2=0.999；通过回收率，当样品中添加质量分数为0.2 μg/kg雌酮时，信/噪比（S/N）大于3，当样品中添加质量分数为0.8 μg/kg雌酮时，信/噪比（S/N）大于10，所以本方法确定雌酮的检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.8 μg/kg，好于国内相关文献对雌酮检测(GC/MS法)的灵敏度要求。

2.4 不同标准品加入量的回收率及重复性

在不同样品中分别添加1，5和10 μg/L雌酮，按本研究方法进行提取、净化和衍生化，GC-MS分析结果如表1所示。标准样品和添加样品总离子（TIC）色谱图和选择监测离子质谱图如图3～图5所示。

表1 雌酮在样品中不同添加浓度的回收率和精密度

图3 标准品中雌酮的色谱图

图4 样品加标色谱图

由表1可以看出，分析方法重复性良好，相对标准偏差为2.0%～3.7%，雌酮不同加入量的加标回收率分别为70.1%～93.6%。

2.5 阴性对照品的检测

称取样品俩份，按添加样品相同的步骤提取、净化、衍生，GC-MS分析，均未检测出雌酮，且添加样品雌酮色谱出峰处未见明显杂峰，干扰较少。空白色谱图如图6所示。

图5 选择监测离子质谱图

图6 空白样品色谱图

3 结论

本文所建立的奶与奶制品中雌酮测定方法准确可靠，重现性好，回收率满意，操作较简便，为国家建立相应的检测方法和标准提供了科研思路和科学技术参考，同时为打击不法分子使用雌酮提供了技术保证。

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Determination of estrone in milk and milk product with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Yong-jun1,LIU Chuang-ji1,JIANG Yan-bin1,WU Yin-liang2,LEI Chun-juan1
（1.China Animal Disease Center,Beijing 100125，China；2.Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo 315000，China）

The residual veterinary drug of estrone in milk and milk product was extracted and purified by the method of liquid-liquid partition and solid phase extraction.The estrone was separated and validated by gas chromatography spectrometry(selected ion mode,the selected ions m/z 218,m/z 244,m/z 257 and m/z 342)after derivatization of the purified sample with the TMS derivative reagent of BSTFA,and the qualitative and quantitative analysis method was developed.Its LOD and LOQ is 0.2 μg/L and 0.8 μg/kg,respectively.and there was a good linear correlation between the ratio of peak areas and the concentration of estrone in the add range of 0.5～1000 μg/L,the correlative coefficient is 0.999,the recoveries of different concentration of estrone was 70.1%～93.6%.The RSD of the method was between 2.0%and 3.7%.The method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of estrone in the milk and milk product.

solid phase extraction;Gas chromatography-Mass Spectrometry;estrone;selected ion monitoring

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0045-03

2010-09-09

刘勇军（1976-），男，工程师，主要从事药理毒理与兽药残留研究工作。