婴幼儿配方乳粉中5种核苷酸的HPLC检测方法

宋畅

（多美滋婴幼儿食品有限公司质量和食品安全部，上海201206）

婴幼儿配方乳粉中5种核苷酸的HPLC检测方法

宋畅

（多美滋婴幼儿食品有限公司质量和食品安全部，上海201206）

研究了液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中5种核苷酸的液相色谱检测方法。样品经酸沉淀后调节pH值为6.5～7.0，以液相色谱于278 nm,257 nm波长检测。各核苷酸的定量限：胞苷酸CMP为1.6 mg/100 g,尿苷酸UMP为1.7 mg/100 g,鸟苷酸GMP为1.8 mg/100 g,次黄嘌呤核苷酸IMP为1.0 mg/100 g,腺苷酸AMP为2.0 mg/100 g。其样品加标回收率为85%～110%。

核苷酸；液相色谱；婴幼儿配方乳粉；

0 引言

核苷酸是乳中非蛋白氨的组织部分，是DNA和RNA的前体物质。核苷酸具有提高婴儿免疫力，促进肠道乳酸菌繁殖，参与脂肪代谢，促进长链不饱和脂肪酸的产生，有助于神经系统发育等多种生理功能,也为提高婴儿的免疫能力和记忆能力发挥作用。

目前国内的婴幼儿配方乳粉中基本都添加了4～5种核苷酸：胞苷酸CMP，腺苷酸AMP，鸟苷酸GMP，尿苷酸UMP，次黄嘌呤核苷酸IMP。

本文研究了采用HPLC-UV方法对婴幼儿配方乳粉中的以上4种核苷酸进行检测。

1 实验

1.1 仪器和试剂

Agilent1100高效液相色谱仪，二极管阵列紫外检测器或双波长紫外检测器，自动进样器；恒温水浴锅；pH计。

核苷酸标准溶液：准确称取约20～40我mg CMP,UMP,AMP,GMP标准品于100 mL容量瓶中，以水稀释到100 mL。分别取此溶液1,2,3,5 mL以水稀释到100 mL。

所用试剂为分析纯，色谱纯；水为去离子水。

1.2 方法

称取5 g样品，以30 mL水溶解，加入3 mL质量分数为13%高氯酸，放置30 min后以水稀释到50 mL,过滤后取15 mL滤液，以浓度为5 mol/L的NaOH调节pH值至6.5～7.0，然后以水稀释到25 mL,过0.45 μm滤膜后进样。

1.3 色谱条件

色谱柱:Supelcosil-18-T,25cm×4.6mm,5 μm。

流动相：3.12 g磷酸二氢钾，加入6 mL浓度为0.4 mol/L的TAH和140 mL甲醇，加入1 500 mL水后调节pH值为4.5，以水稀释到2 L。

检测波长278 nm，257 nm。进样量为20 μL。

1.4 测定步骤

1.4.1 色谱平衡

由于流动相中添加了离子对试剂，其色谱柱平衡时间需要至少4 h以上。仪器平衡后连续进标准品，待出峰时间稳定后，表示色谱系统已平衡，可以进行分析。

样品分析结果如图1图2所示。

1.4.2 计算

按下式计算各核苷酸的质量分数，即

式中：C为进样溶液中各核苷酸的质量浓度(mg/L)；W为称样量。

图1 标准品谱图

图2 样品谱图

2 结果和讨论

2.1 沉淀剂的选择

比较了3种不同的蛋白沉淀方法：酸沉淀，有机试剂乙腈沉淀和采用亚铁氰化钾与醋酸锌盐析沉淀。发现乙腈沉淀不能广泛适用于各种配方乳粉，它市场上某些配方乳粉不能起到很好的沉淀作用。盐沉淀虽然沉淀效果较好，但它对液相色谱分离有干扰。对酸沉淀，我们选择了几种不同的酸进行实验，最后发现质量分数为13%高氯酸广泛适用于各种配方乳粉的蛋白沉淀。

2.2 流动相pH值的影响

由于核苷酸在酸性调件下稳定，所以选择偏酸性的流动相。流动相pH值越低，核苷酸出峰时间越快，选用pH值为4.5的流动相可以使5种核苷酸在色谱柱上均得到较好的分离，检测时间又可以控制在40 min之内。

2.3 方法的的精密度

取3种不同核苷酸质量分数水平的婴幼儿配方乳粉各一份，按上述实验方法进行定量分析，不同时间重复6次平行试验，进行统计计算。其中次黄嘌呤核苷酸选择的添加量很低，是因为担心它可能会转化为尿酸从而对健康带来长期不利影响，所以在婴幼儿配方粉中添加量一般都不高。其结果表1所示。

方法的相对标准偏差基本小于10%,IMP虽然添加的含量水平较低，其相对标准偏差差也＜15%。

表1 核苷酸精密度（RSD）mg/100 g

2.4 回收率

取无核苷酸奶粉样品添加3次不同量的5种核苷酸标准品，按上述实验方法定量分析后检查其回收率，如表2。

表2 回收率

2.5 定量限

本方法中5种核苷酸的定量限分别为：CMP 1.6 mg/100 g，UMP 1.7 mg/100 g，GMP 1.8 mg/100 g,IMP 1.0 mg/100 g，AMP 2.0 mg/100 g。其样品加标回收率为85%～110%。

2.6 检出限

本方法中各核苷酸的检出限分别为：CMP 1.1 mg/kg，UMP 1.6 mg/kg，GMP 1.6 mg/kg，IMP 1.5 mg/kg，AMP 1.3 mg/kg。

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Determination of nucleotide in infant formula

SONG Chang
(Dumex Baby Food Co.Ltd.,QFS,ShangHai 201206，China）

A HPLC method was developed for determination of nucleotide in infant formula.The sample is precipitated by 13%perchloric acid and adjust pH to 6.5～7.0.Nucleotide is detected by HPLC at 278 nm and 257 nm.The LOQ of the nucleotide were:CMP1.6 mg/100 g,UMP 1.7 mg/100 g,GMP1.8 mg/100 g,IMP1.0mg/100 g,AMP2.0 mg/100 g.The average recovery is in the range of 85%～110%.

Nucleotide;HPLC;Infant formula;

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0048-02

2010-07-19

宋畅（1970-），女，硕士研究生，从事检测方法的开发研究。