具有潜在抑制肠道致病菌的乳酸菌的筛选

张英春，张兰威，韩雪，易华西，杜明，妥彦峰，李靖妍

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨150090；2.新疆塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

具有潜在抑制肠道致病菌的乳酸菌的筛选

张英春1，张兰威1，韩雪1，易华西1，杜明1，妥彦峰2，李靖妍1

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨150090；2.新疆塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

以西北地区发酵食品分离出的106株乳酸杆菌为材料，通过其代谢产物对肠道致病菌生长的抑制作用、菌体HT-29细胞的粘附作用和抑制宋内志贺氏菌（S.sonnei）对HT-29细胞的黏附作用筛选出了具有抑制肠道致病菌作用的三株乳酸杆菌，为进一步的体内实验奠定了基础。

乳酸杆菌；致病菌；抑制致病菌生长；抑制黏附

0 引言

乳酸杆菌是人类和动物肠道中一种正常的优势有益菌，能够维持肠道微环境的平衡作用[1]。研究表明乳酸杆主要是通过产生抗菌物质，竞争粘附位点等方式拮抗多种病原菌的作用[2，3]。然而通过体内实验来筛选具有抑菌作用的乳酸杆菌不仅价格昂贵、而且耗时。因此利用可靠的体外方法筛选具有潜在抑菌活性的菌株是必要的。西北地区传统的发酵制品中拥有丰富的乳酸杆菌资源，这些菌株来源于当地的自然环境，不仅赋予食品特有的营养价值和风味，而且具有很好的抗逆性和益生性。本研究利用乳酸杆菌体外抑制致病菌的生长、抑制致病菌对肠道上皮细胞的黏附作用[4]的实验方法对所分离的乳酸杆菌的抑菌活性进行了体外筛选研究，为进一步的体内试验提供数据基础。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株和细胞株

实验所用的乳酸杆菌都是分离于西北地区传统发酵制品中，主要有甘肃甘南藏族自治州（G）、甘肃肃北蒙古族自治县（SB）、青海海北藏族自治州牧民自制的牦牛乳酸奶（Q）；新疆哈萨克族牧民自制的马奶酒（M）及奶酪（X）；西藏拉萨地区牧民自制的奶酪（T）；兰州市民自制的发酵蔬菜汁浆水，分纯的乳酸菌经过革兰氏染色、过氧化氢酶试验初步确定为乳酸杆菌，共计106株。指示菌株为大肠埃希菌（E.coli，ATCC25922），鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium，ATCC14028），宋内志贺氏（S.sonnei，ATCC25931），HT-29细胞株。

1.1.2 试剂和仪器

MRS用于培养乳酸杆菌，TSA用于培养致病菌，RPMI1640细胞培养液，胰蛋白酶，胎牛血清，蛋白酶K，Biolog AN微生物鉴定板，6孔细胞培养板、12孔细胞培养板，双筒电光显微镜，CO2培养箱。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌抑制致病菌的初筛

采用琼脂扩散法测定乳酸杆菌对致病菌的抑制性[5]。将分纯供试菌株活化2～3代。取1 mL的致病菌悬液（107mL-1）于灭菌的平皿中，倾入灭菌的TSA培养基，待其凝固后，用灭菌的打孔器在平皿内打孔，孔径为5 mm，每个平皿打4个孔，然后每孔中加入50 μL的乳酸杆菌发酵液，在37℃条件下培养18 h，同时用MRS培养基做阳性对照，记录抑菌圈的大小，与对照组相比抑菌圈直径大于等于1 mm为阳性，每个样品做4个平行。

1.2.2 乳酸菌的黏附性筛选

（1）HT-29细胞培养

使用RPMI1640培养液培养HT-29细胞，HT-29细胞在5%CO2培养箱里37℃培养，每48 h换液1次，连续培养15 d。将盖玻片放在6孔组织培养板中，向孔中加入1 mL浓度为4×105mL-1的细胞培养液，每天更换细胞培养液，至到在玻璃盖玻片上形成单层细胞。

（2）黏附实验[6]

乳酸杆菌在MRS液体培养基中37℃培养18～20 h。取1 mL菌体培养液（108mL-1）并加入1 mL RPMI1640培养液制成2 mL细菌悬浮液。吸出6孔组织培养板中HT-29细胞培养液，用PBS缓冲液（pH值为7.4）冲洗HT-29细胞2次。然后将上述2 mL乳酸杆菌RPMI1640悬浮液加入到培养孔中。组织培养板继续在5%CO2和95%空气的环境中37℃培养2 h，然后将细菌悬浮液吸出，用PBS（pH值为7.4）冲洗HT-29细胞5次，然后用甲醇固定，革兰氏染色，于100倍油镜下镜检。随机选取20个视野计数HT-29细胞所黏附的细菌数，计算每100个细胞所黏附的细菌数，作为黏附指数（AI），每株菌做2个重复。

1.2.3 初筛菌株的鉴定

综合抑菌性和粘附性实验结果将初筛菌株进行了鉴定。采用Biolog微生物鉴定系统提供的“Biolog AN微生物鉴定板”对7株菌进行了鉴定，主要是依据乳酸杆菌对鉴定板所提供的95种碳源的利用情况进行了属种鉴定。

1.2.4 发酵液中抑菌物质性质的分析

本研究将筛选的7株乳酸杆菌制备上清液（Cell-Free Culture Supernatants，CFCS)，将上清液进行如下处理[7]，通过琼脂扩散法来初步测定发生抑菌作用的主要物质，每个处理组为2 mL，每个实验做3个平行，两次重复。

(1)未处理的CFCS；

(2)CFCS对热的敏感性：将CFCS加热处理（80℃，15 min）；

(3)CFCS对蛋白酶的敏感性：CFCS中加入蛋白酶κ（200 mg/L）于37℃条件下培养3 h后备用；

(4)用浓度为10 μmol/L的NaOH将CFCS的pH值至6.5。

1.2.5 乳酸杆菌筛选[8，9]

将瓶中培养好的HT-29细胞解析下来制备成3×105的细胞悬液，接入到用12孔培养板中培养至形成单层细胞。用PBS（pH=7.4）清洗2次后，每孔中加入0.4 mL的1640培养液，然后每个孔中加入100 μL的乳酸杆菌菌悬液（1×108mL-1），在37℃和5%CO2/95%的空气条件下分别培养1 h，然后加入100 μL的S.sonnei（1×108mL-1），在37℃和5%CO2/95%的空气条件下继续培养1 h。实验结束后单层细胞用PBS洗涤4次后，加入0.5%的TritonX-100，0.5 mL，在冰水浴中解析5 min，从细胞上解析下来的菌体进行梯度稀释后，用TSA来计数实验组和对照组中的S.sonnei数量，对照组中只加S.sonnei，每个实验做3个平行，5次重复。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌能力菌株的筛选

通过对传统发酵制品中106株乳酸杆菌的抑菌作用筛选，初步筛选出38株对3种致病菌具有不同程度的抑菌作用，如表1。另外大多数菌株对S.sonnei的抑制作用高于对E.coli和S.typhimurium的抑制作用。同比从浆水中分离的菌株，其抑菌作用更强一些，如：J21-L，J10-L和J23-L等。

2.2 具有黏附性菌株的筛选

乳酸菌能够黏附到肠道上皮细胞是其进一步发挥作用的前提，具有较强黏附能力的乳酸杆菌在肠道定殖后，可以有效的防止病原微生物接触和粘附肠粘膜细胞，从而预防肠致病菌引起的肠道疾病[10]。本研究将抑菌效果较好的38株菌株，采用HT-29细胞株进行了黏附实验，结果如表1所示。菌株黏附能力的评价标准：每20个视野中菌株的数量少于50为无黏附能力；黏附的菌株数量在51～100，具有黏附能力；黏附的菌株数量超过100为强黏附能力[4]。由表1可以看出，在测定的菌株中黏附指数大于50的菌株包括SB32，SB14，SB27，M22-L，M7-L，M6-L，M20-L，Q8-L，Q2-L，M5-L，M25-L，Q6-L，Q12-L，X12-L，X2-L，G15-L，G1-L，J21-L，J10-L。结合乳酸菌株的抑菌性，最后筛选出7株乳酸杆菌。

2.3 初筛菌株的鉴定

采用Biolog微生物鉴定系统对初筛出的7株乳酸杆菌进行了鉴定，结果如表2所示。

表2中，a为根据Biolog微生物鉴定系统的要求，当SIM值＞0.5时,鉴定结果具有准确性和可靠性。b为这些传统发酵食品采用传统方法制作，具有独特的风味，深受当地居民喜爱，在当地居民的膳食中占据重要地位。

2.4 乳酸杆菌发酵液中抑菌物质性质的分析

将7株乳酸杆菌的发酵液进行了不同处理后，进行了抑菌试验，结果如表3。在结果中可以看出，当将CFCS进行蛋白酶K处理和热处理时，并没有影响其抑菌活性，初步可以判定这7株乳酸杆菌并没有产生抗菌肽类物质。而当将CFCS的pH调至为6.5时，这7株乳酸杆菌的抑菌活性全部消失，初步可以确定乳酸杆菌代谢过程中产生的有机酸类发挥重要作用。资料也报到了L.casei Shirota和L.rhamnosus GG的抗菌活性主要也是由于产生有机酸的作用[3]。有机酸，特别是丁二酸，不仅对肠道致病菌起到一个屏障作用，而且对于维持肠道的健康也发挥着重要的作用[11]，另外通过本研究未能筛选出产生抗菌肽的菌株。

表1 初筛乳酸杆菌对致病菌的抑制性及其在HT-29细胞上的黏附性

表2 筛选乳酸杆菌菌株的鉴定和来源

表3 不同处理乳酸杆菌CFCS对致病菌的抑制作用

2.5 抑制S.sonnei对HT-29细胞的黏附作用菌株的筛选

图1为乳酸杆菌抑制S.sonnei在HT-29细胞上的黏附作用。

图1 乳酸杆菌抑制S.sonnei的黏附作用

在抑制S.sonnei对HT-29细胞的黏附性实验中，从表1的数据统计分析中可以看出，先加入M5-L，Q8-L和J10-L乳酸杆菌菌株培养1 h后，再加入S.sonnei，S.sonnei的黏附菌数与对照组相比差异显著（P＜0.05），而且对S.sonnei抑制率分别为55%，36.4%和38.1%。而J21-L，X12-L，Q6-L和G15-L加入后，虽然S.sonnei的黏附菌数与对照组相比也有所减少，但是统计分析差异不显著（P＞0.05），对S.sonnei抑制率都低于30%。资料已经报到了Lactobacillus crispatus strain ZJ001能够抑制39%和35%的E.coli和S.typhimurium对上皮细胞的粘附作用[12]。另外Candeal et al.报道[8]了菌株Lactobacillus acidophilus Bar13和L.plantarum Bar10能够抑制肠道致病菌E.coli和S.typhimurium在Caco-2细胞上黏附，因此利用乳酸杆菌预防肠道致病菌引起的某些肠道疾病是具有一定基础的。

3 结论

通过乳酸杆菌代谢产物体外抑制致病菌的生长和乳酸杆菌对HT-29细胞的黏附作用，初步筛选出7株乳酸杆菌L.paracasei subp.paracasei M5-L，L.rhamnosus J10-L，L.paracasei subp.paracasei J21-L，L.casei Q8-L，L.paracasei subp.paracasei X12-L，L.delbrueckii subsp.bulgaricus Q6-L和L.paracasei subp.paracasei G15-L。

通过抑制S.sonnei对HT-29上皮细胞的粘附作用研究，从7株乳酸杆菌中筛选出3株具有显著抑制作用的菌株L.paracasei subp.paracasei M5-L，L.rhamnosus J10-L和L.casei Q8-L。为进一步的体内试验研究提供实验数据。

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In vitro screening of Lactobacilli strains potential to inhibition the Enteropathogens

ZHANG Ying-chun1,ZHANG Lan-wei1,HAN Xue1，YI Hua-xi1，DU Ming1，TUO Yan-feng2,LI Jing-yan1
(1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China 2.Department of Life Science,Tarim University,Alar,Sinkiang 843300,China)

By analyzing the production of antimicrobial molecules active against E.coli,S.typhimurium and S.sonnei,adherence to HT-29 cells and inhibition of S.sonnei adherence to HT-29 cells,Three lactobacilli were screened from 106 lactobacilli strains from Chinese fermented food for inhibition the enteropathogens,which could lay a foundation for further investigation in vivo

Lactobacilli;enteropathogens;inhibition the growth of enteropathogens;inhibition adhesion

Q93.331

A

1001-2230（2011）02-0009-04

2010-10-19

益生菌定向选育及其高活性制品开发关键技术（2007AA10 Z354）。

张英春（1975-），女，讲师，研究方向为乳酸菌及其活性产物研究。

张兰威