高产胞外多糖嗜热链球菌混菌培养特性研究

马艳，陈历俊，王昌禄，牟光庆，陈晓璇

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034；2.北京三元食品股份有限公司技术中心，北京100085；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

高产胞外多糖嗜热链球菌混菌培养特性研究

马艳1，陈历俊2，王昌禄3，牟光庆1，陈晓璇1

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034；2.北京三元食品股份有限公司技术中心，北京100085；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

探讨高产胞外多糖嗜热链球菌混菌培养的产酸、产香、产黏特性。以发酵酸度、乙醛质量浓度和黏度为综合指标，确定高产胞外多糖的嗜热链球菌（S.t.）、保加利亚乳杆菌（L.b.）、嗜酸乳杆菌（L.a.）混菌最佳培养条件为培养温度42℃，总接菌量体积分数4%，V（S.t.）︰V（L.b.）︰V（L.a.）=3︰2︰1。在此条件下，混菌培养可以显著地提高酸度、乙醛质量浓度、黏度、胞外多糖质量浓度、β-半乳糖苷酶酶活、蛋白酶水解能力（P＜0.01）。发酵过程中，胞外多糖质量浓度与黏度，β-半乳糖苷酶酶活与酸度，蛋白酶酶活与酸度、乙醛质量浓度的相关性系数很高。

胞外多糖；混菌培养；酸度；黏度

0 引言

酸奶的品质很大程度上取决于乳酸菌发酵剂的质量，性状优良的发酵剂是高品质发酵乳的保证。目前我国对乳酸菌发酵剂的研究尚处于初级阶段，虽然添加稳定剂可改善发酵乳制品的结构和质地，但同时在一定程度上掩盖了酸奶的真实味道[1]。酸奶发酵剂若有产粘菌株存在，则会极大提高产品的质地、组织状态和功能特性。

目前对于高产胞外多糖乳酸菌混合培养的研究报道很少，本文将一株从西藏雪莲中筛选的高产胞外多糖的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌和产酸能力强、具有益生性嗜酸乳杆菌混合培养，确定其产酸、产香和产黏特性的最佳发酵条件，同时研究了混菌在发酵过程中的产物变化情况，为提高酸奶的组织状态以及研制高效直投式酸奶发酵剂等提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

嗜热链球菌(Streotococcus thermophillus)，西藏雪莲中筛选；高产胞外多糖，由内蒙古农业大学乳酸菌菌库提供；保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，本实验室保藏菌种。

12%的脱脂乳，MRS固体培养基，改良IRIE固体培养基。

1.2 仪器

756PC紫外可见分光光度计，YZ280A手提式不锈钢蒸汽消毒器，LG16-W高速微量离心机，DRP-9162型电热恒温培养箱，722型光栅分光光度计，DK-S22型恒温水浴锅、JY99-2D超声波细胞粉碎机。

1.3 方法

1.3.1 共生性与混菌最佳培养条件的优化

稀释平板计数法比较混菌培养与单菌培养的活菌数，确定其共生性。

以酸度、乙醛质量浓度、黏度的综合评分为指标确定混菌最佳培养条件，即：菌种比例、培养温度、接菌量。

1.3.2 滴定酸度的测定

酸度测定按GB/T5009.46-2003(乳与乳制品卫生标准的分析方法)进行。

1.3.3 乙醛的测定[2]

酸奶样品中的乙醛在酸性条件下与亚硫酸氢钠发生加成反应生成乙醛亚硫酸氢钠，其剩余的亚硫酸氢钠被碘氧化。在碱性条件下，乙醛亚硫酸氢钠与碘定量反应，根据浓度关系计算乙醛质量浓度。

1.3.4 黏度和胞外多糖质量分数测定

黏度测定采用NDJ-1型旋转黏度计，选择合适转子测定。

胞外多糖质量分数测定采用硫酸-苯酚法测定粗多糖质量分数[3]。

1.3.5 β-半乳糖苷酶酶活和蛋白酶水解能力测定

β-半乳糖苷酶酶活的测定：超声细胞破壁技术提取粗酶液，采用硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）为酶作用底物，生成有色产物ONP，通过比色法来测定[4]。一个酶活力单位(U)定义为在37℃每分钟释放1 μmol ONP所需的酶量。

蛋白酶水解能力的测定采用茚三酮法，以水解的氨基酸总量表示(mg/L)[5]。

1.3.6 数据的差异性和相关性分析

采用origin软件处理数据，spss13.0软件进行相关性和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 共生性与混菌最佳培养条件的确定

菌株在质量分数为12%的脱脂乳中培养，稀释平板计数确定3菌两两共生，这与吴荣荣[6]、赵瑞香[7]等的研究基本一致。

如果酸奶发酵剂杆菌占优势，产酸过多会影响酸奶的口感和风味，故发酵剂中球杆菌比例一般为2︰1和1︰1。选择菌种比例、培养温度、接种量3个因素作3水平正交实验L9（33），正交实验设计与结果见表1。通过加权评分法，对产酸、产香、产黏特性给予相同的权重系数，即酸度、乙醛质量浓度、黏度分别占总评分的1/3，再进行加权求和，综合评分Yi=（1/3×Yi1/Yi1max+1/3×Yi2/Yi2max+1/3×Yi3/Yi3max）×100，试验确定多指标正交实验的最佳组合为A2B3C3，即V（S.t.）︰V（L.b.）︰V（L.a.）=3︰2︰1，培养温度为42℃，接菌量为4%，由极差分析可知，因素对试验指标影响的主次顺序是C＞B＞A，即接菌量对产酸、产香、产黏特性影响最大，其次是温度，菌种比例对其影响最小。有研究表明[8]，混合菌种发酵的酸奶在风味和保健功能等方面明显优于单一菌种发酵的酸奶。

表1 L9（33）正交实验设计与结果

2.2 发酵过程中产酸、产香和产黏物质的变化与比较

在最佳培养条件下，单、混菌均接种在脱脂乳培养基中，单菌接菌量仍为4%。图1为不同菌种发酵过程中活菌数、酸度、乙醛质量浓度变化趋势。图1(a)表明单、混菌均在8 h达到对数生长期，单、混菌活菌数差异达到极显著水平（P＜0.01），8 h混菌活菌数可达108mL-1以上，其中，lg(S.t.):lg(L.a.):lg(L.b.)=8.79∶6.64∶6.10。

由图1（b）可以看出，单、混菌随着发酵时间的延长，酸度均呈上升趋势，其中0～8 h上升较快，8 h后酸度趋于平稳。比较发现，4 h后同期的单、混菌酸度差异达到极显著水平（P＜0.01），表明混菌培养可提高酸度，单菌培养中嗜酸乳杆菌产酸能力较强。

图1（c）表明，在发酵过程中，乙醛质量浓度均呈上升趋势，3株单菌中保加利亚乳杆菌乙醛质量浓度较高，6 h后同期的单、混菌乙醛质量浓度差异达到极显著水平（P＜0.01），表明乳酸菌共生性可以显著提高乙醛的产量。有文献报道[9，10]，主要风味物质乙醛多由保加利亚乳杆菌发酵产生，混合菌株发酵要比单一菌株发酵产生的芳香物质多。

图2为不同菌种发酵过程中黏度、胞外多糖质量浓度变化趋势。单、混菌的黏度随发酵时间呈上升趋势（图2（a）），0～8 h上升较快。6 h后同期的单、混菌黏度值差异达到极显著性水平（P＜0.01），表明混菌培养促进粘度的增加，单菌培养高产胞外多糖的嗜热链球菌黏度较高。

由图2（b）可以看出，胞外多糖的质量浓度与黏度变化趋势相同，其中混菌的胞外多糖质量浓度和黏度的相关系数R为0.956，达到极显著水平（P＜0.01），4 h后同期的单、混菌胞外多糖质量浓度差异达到极显著性水平（P＜0.01），结果表明，混菌胞外多糖质量浓度的增多促进了其黏度的增加。高产胞外多糖的菌株所具有的黏性、稳定性和持水性功能，可以改善发酵乳制品的口感、质地结构和风味[11]。

2.3 发酵过程中相关酶活的变化与比较

β-半乳糖苷酶是乳糖代谢的关键酶，可降低乳糖的含量，解决乳糖不耐症。图3为不同菌种发酵过程中β-半乳糖苷酶酶活、蛋白酶水解能力变化趋势。

由图3（a）可知，不同菌种在发酵过程中0～8 h乳糖酶活力上升较快。4 h后同期的单、混菌β-半乳糖苷酶活力差异达到极显著水平（P＜0.01），混菌β-半乳糖苷酶酶活8h达到最大值0.148 U/mL。单菌培养β-半乳糖苷酶酶活差异不显著。

适度的蛋白酶水解对改善酸乳的质地和风味是必要的，由图3（b）可看出，蛋白酶水解生成氨基酸量随着发酵时间的延长而增加，0～8 h上升趋势明显，8 h后同期单、混菌的蛋白酶水解氨基酸含量差异达到极显著水平（P＜0.01），表明混菌的共生性促进蛋白酶水解生成氨基酸。单菌培养中保加利亚乳杆菌蛋白酶的水解能力最强，有文献报道[12,13]，保加利亚乳杆菌蛋白酶具有很强的蛋白水解能力,将大量的蛋白质分解产生氨基酸促进了嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌的生长。

2.4 酶活与产酸、产香和产黏特性的相关性

表2为混菌在发酵过程中各指标的相关系数。混菌在发酵过程中，酸度与活菌数的相关性系数为0.987（P＜0.01），乙醛质量浓度与酸度的相关系数达0.990（P＜0.01），乙醛质量浓度与活菌数的相关系数达0.990（P＜0.01），乙醛产量主要集中在8 h后的活菌对数生长期；蛋白酶水解能力与酸度和乙醛质量浓度的相关系数R分别高达0.996和0.992（P＜0.01）。有研究表明[14]，蛋白酶水解产生的氨基酸是乙醛合成的前体物质，蛋白酶水解能力强则乙醛合成量多，这与试验结果相符；0～8 h混菌培养所产生的β-半乳糖苷酶酶活与酸度的相关系数R高达0.992，β-半乳糖苷酶能水解乳糖产生乳酸，该酶活性高则产生乳酸快，而8 h后两者的相关性系数降低，这是由于乳酸过高会抑制β-半乳糖苷酶的活性，活性下降，但仍催化乳糖生成乳酸，只是乳酸的生成速度降低[15，16]。

表2 混菌各指标的相关系数

3 结论

（1）高产胞外多糖的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌能够两两共生；混菌的最佳培养条件为培养温度42℃，接菌量4%，V（S.t.）︰V（L.b.）︰V（L.a.）=3︰2︰1；因素对试验综合指标影响的主次顺序是：接菌量＞温度＞菌种比例。

（2）在混菌最佳培养条件下，酸度、乙醛质量浓度、黏度、胞外多糖质量浓度、蛋白酶水解能力随发酵时间的延长呈上升趋势，混菌与同期单菌的指标差异达到极显著水平（P＜0.01），表明：混菌培养显著提高了其产酸、产香、产黏特性。其中，嗜热链球菌产粘特性较好，保加利亚乳杆菌产香特性较好，嗜酸乳杆菌产酸较强。

（3）在混菌发酵过程中，活菌数与酸度、乙醛质量浓度；所产乳酸菌胞外多糖与黏度；β-半乳糖苷酶酶活与酸度；蛋白酶酶活与酸度、乙醛质量浓度的相关性系数较高。

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Study on the mixed cultivated properties of high exopolysacchride-producing Streotococcus thermophillus

MA Yan1,CHEN Li-jun2,WANG Chang-lu3,MU Guang-qing1,CHEN Xiao-xuan1
（1.School of Food Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Technology Center;Beijing Sanyuan Foods Co.Ltd.，Beijing 100085,China;3.College of Food Engineering and Biotechnology;Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

The aim of this research is to study the acidity,acetaldehyde and viscosity of mixed cultivation with high exopolysaccharides-producing Streptococcus thermophilus.The optimal fermentation conditions with mixed cultivation are:42℃,inoculation size 4%(v/v),the strains matching ratio of high exopolysaccharides-producing Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus acidophilus is 3∶2∶1 according to acidity,content of acetaldehyde and viscosity.On this condition,mixed cultivation of Lactic acid bacteria significantly improve acidity,acetaldehyde content,viscosity,exopolysaccharide(EPS),the activity of β-galactosidase and protease（P＜0.01).The correlative modulus of EPS and viscosity,the activity of β-galactosidase and acidity,the activity of protease and acidity,acetaldehyde content is high.

Exopolysaccharide(EPS);mixed cultivation;acidity;viscosity

Q93-335

A

1001-2230（2011）01-0015-04

2010-09-07

辽宁省教育厅创新团队项目（2009T013）。

马艳（1984-），女，硕士研究生，研究方向为微生物资源与利用。

牟光庆