汉族人群家族性肥厚型心肌病TNNI3基因突变研究

南京市江宁医院（211100）陶琴

苏州大学附属第一人民医院（215006）杨俊华

附图 与HCM相关的TNNI3突变位点分布图

自1997年Kimura等首次发现TNNI3基因突变可导致HCM[1]，至今已发现20多种TNNI3突变[2]，除R21C、P82S突变分别位于第3号及第5号外显子外，其余大部分位于第7、第8号外显子，如附图。本研究对14例家族性HCM患者第3、5、7、8号外显子进行扫描，旨在发现在这一范围上有无基因突变位点。

1 材料与方法

1.1 材料 无血缘关系的肥厚型心肌病患者14例，均为2002年至2006年江苏地区门诊及住院的HCM患者，年龄16～62岁，其中男性6例，女性8例，每例患者其家族中至少有两人发病。临床资料包括体检、心电图、二维及多普勒超声心动图检查。HCM患者诊断标准：超声心动图检查室间隔或心室壁厚度≥13mm，排除高血压、主动脉瓣狭窄等其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病（诊断依据WHO/ISFC1996年公布标准）。FHCM诊断标准：患者(先证者)家族中有多人发病，并符合常染色体显性遗传特点：①患者双亲中一方患病，致病基因由患病亲代传来；②患者同胞中1/2将会发病，而且男女患病机会均等；③患者子代中有1/2将患病；④可几代连续传递。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采集HCM患者及正常对照组的外周静脉血2ml，枸橼酸钾抗凝，采用QIAGEN公司试剂盒，从白细胞中提取其基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR)扩增基因组DNA根据文献报道设计TNNI3 基因第3、5、7、8号外显子含侧翼内含子序列的引物（附表1）。由上海生工（sangon）生物技术公司合成。PCR扩增体系：50μl反应体系含基因组DNA500ng，上下游引物各10pmol，10xbuffer5μl，dNTP200μmol，TaqDNA聚合酶2.5U（由上海生工生物技术公司提供）。PCR扩增条件：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火（见附表）30s，延伸72℃，45s；共34个循环；最后延伸72℃，10min。PCR仪为东胜创新生物科技公司的PTC-200。

1.2.3 PCR产物测序并检测突变位点 按双脱氧末端终止法进行测序（美国ABI公司3730XL自动测序仪），测序引物与PCR引物相同，TNNI3 基因7号外显子的目的片段大小约177bp。运用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq程序来分析测序结果，检测是否具有突变位点。

2 结果

2.1 心肌肌钙蛋白I的PCR扩增产物琼脂电泳结果 4对引物设计合成后，取正常人（门诊体检合格）基因组DNA，PCR分别扩增心肌肌钙蛋白I基因3、5、7、8号外显子，15g/L琼脂糖电泳产物，可见碱基数目相当的电泳条带，同时送上海英骏公司测序，结果证实扩增条带序列与genebank人心肌肌钙蛋白I基因登录标准序列（X90780）完全吻合，分别扩增14例家族性HCM患者TNNI3基因3、5、7、8号外显子。

2.2 测序结果 14例先证者TNNI3基因3、5、7、8号外显子PCR扩增产物单链构型多态性及测序结果显示，未见国外报道的20余种心肌肌钙蛋白I基因突变类型。仅在1个标本7号外显子发现179位密码子GAGGAA的多态性，未引起氨基酸置换，国外[3]、国内均已见报道[4]。

3 讨论

研究的14例家族型肥厚性心肌病先证者，均已在β-肌球蛋白重链基因（β-MyHC）3-26号外显子、肌球蛋白结合蛋白C基因（MYBPC3）2-35号外显子以及肌钙蛋白T基因（TNNT2）2-16号外显子进行突变基因筛查，未见异常。本次研究中，对该14例先证者的心肌肌钙蛋白I基因第3、5、7、8号外显子进行检测，未发现国内外已报道的该基因上的20余种突变类型。

分析原因可能如下：①心肌肌钙蛋白I基因突变可能在我国肥厚型心肌病患者中发生率不高，未达到国外报道的水平。②突变可能主要分布在其它未检测的基因外显子上，而不是3、5、7、8号外显子。③纳入人群样本量小，进一步研究需加大样本累积。而在TNNI3基因第7号外显子见179位密码子GAG-GAA多态性（均编码谷氨酸）未引起氨基酸置换，在正常人群中亦可见，无特别意义。

本研究可能提示中国汉族人群家族性肥厚型心肌病患者致病基因分布特点与国外人群不同[5～7]，肌钙蛋白I基因突变在中国汉族家族性肥厚型心肌病患者中发病率偏低。

4 讨论

随着分子生物学技术的进步和对HCM基因突变研究的深入，已有越来越多的突变基因被发现，关于基因型与表型的关系的阐述也越来越明了。但HCM作为一种基因多态性疾病，其致病基因及突变类型复杂多变，致病基因远未被完全揭示，影响其预后的因素也远未被阐明，对临床工作的指导作用还很局限。因此还需要进行更多的工作来揭示导致HCM的突变基因谱，揭示基因突变与临床表现及预后的关系，为基因治疗打下基础。

附表 TNNI3基因各外显子PCR扩增引物及退火温度