正交试验优选复方叶下珠的水提制备工艺

汕头大学医学院附属粤北人民医院（512026）徐晓梅 谭本仁

顺德顺风药业有限公司（528300）刘贤英

汕头大学医学院附属粤北人民医院（512026）许卫关

复方叶下珠由叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草、茵陈、丹参、柴胡等十六味药组成，具有疏肝解郁，益气健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能，调节免疫机能等功效。主治急慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。实验为优选复方叶下珠的最佳提取工艺，以君药叶下珠所含没食子酸含量为指标成分，以煎煮时间、加水量、醇沉浓度三个对提取物收率影响较大的条件为考察因素，按L9(34)正交表进行试验，以优选出用于该制剂生产的最佳水提取工艺，从而更好地控制制剂质量，保证药物疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国 Waters 高效液相色谱仪、高效液相色谱仪(waters1525泵、717 自动进样器、2487 紫外检测器)；液相色谱柱(Microsorb-MV10-5，C18，250 mm ×4.6 mm，5μm)

1.2 试药 药材：叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草、茵陈、丹参、柴胡等经鉴定为真品；没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110831-200302），水为重蒸水，试剂皆为分析纯。

2 实验方法

2.1 提取溶媒的选择 复方叶下珠是由叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草等药材组成的，其中活性作用比较明确的有叶下珠的没食子酸，叶下珠素，半边莲的L-山梗菜碱、延胡索酸，半枝莲的黄芩苷、原儿茶酸以及鸡骨草的相思子碱、黄酮苷等成分，经多次预试验，确定在不违背中药传统提取工艺的前提下，为充分提高药材的生物提出利用率，本品采用水作为溶媒进行提取。具体提取条件采用正交试验方法进行优选。

2.2 正交试验设计 试验以复方叶下珠中叶下珠没食子酸含量为标准，对煎煮时间、加水量、醇沉浓度三个因素进行考察，每因素设置三个水平，设计正交试验（见附表1），从而选取最佳的水提工艺。

2.3 没食子酸含量测定

通过试验预试结果和参考文献[1]，采用高效液相色谱法测定样品中没食子酸含量，测定方法经验证可行。

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Microsorb-MV10-5，C18柱（250mm×4.6mm，5μm)；检测波长280nm；流动相：甲醇-水-磷酸（4：96：0.05）；流速1ml/min；柱温：室温。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥直恒重的没食子酸对照品约4mg，置10ml的容量瓶中，加30%甲醇溶解并定容配成浓度约为0.4mg/ml的溶液，即得。

2.3.3 标准曲线的制备 精密吸取标准溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5ml，用30%甲醉溶液定容至5ml容量瓶中，分别吸取20μl进样，测定色谱峰面积。以色谱峰面积A为纵坐标，没食子酸对照品的浓度为横坐标，得回归方程 Y=31558X十3677.1（r=0.9994），线性范围为40～200μg/ml，可用外标一点法计算含量。

2.3.4 供试品溶液的制备及供试品测定 分别按处方比例称取9份复方叶下珠中叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草等药材，合计每份总重245g，根据附表1正交试验因素水平，按以下工艺提取：叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草等十多种中药材→加水煎煮→浓缩→酒沉→回收乙醇至流浸膏。精密称取样品约0.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇30ml振荡溶解，用甲醇稀释置刻度，摇匀，过滤，取续滤液即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定计算没食子酸含量。

附表1 正交试验因素水平

3 结果

选用L9(34)正交试验表设计，测定煎液中没食子酸的含量，计算其提取量。试验结果见附表2。

由附表2中数据直观和方差分析可知，对于样品中的没食子酸提取得率来说，A、B、C因素对试验均有显著影响，影响因素为A>B>C。

附表2 方差分析

综合试验结果及实际操作问题，确定提取工艺为A2B2C3，即加水10倍，煎煮1小时，醇沉浓度为60%。

按照上述最佳提取工艺，按处方量称取3份本品中各中药材，合计每份总重735g，试验结果表明该提取工艺下没食子酸提取得率最高，且3批数据接近，说明该工艺稳定、可靠，达到了提取条件优化的目的。

4 讨论

复方叶下珠以叶下珠和半边莲为君药。叶下珠的主要有效成分为没食子酸、叶下珠素。其中，没食子酸有抗HSV活性，能抑制HSV对靶细胞的吸附[2]。叶下珠素能明显降低ALT、AST水平，对CCl4和氨基半乳糖诱发的肝细胞损伤有明显保护作用[3]。半边莲的主要有效成分为山梗菜碱、延胡索酸等具有明显的利胆消炎及抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的作用[4]。

上述有效成分既易溶于水，又易溶于乙醇，为保持该药的特点，发挥中药的复方功效，故在制备工艺上采用水提醇沉法，采用叶下珠中主要活性成分没食子酸提取得率作为指标，通过正交试验用以优选最佳提取工艺。正交试验结果表明，复方叶下珠的最佳提取工艺为加水10倍，煎煮1小时，醇沉浓度为60%。