支原体和肺支原体双通道荧光定量PCR法检测鼠支原体感染试验

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(1.浙江大学实验动物中心，浙江杭州 310058；2.浙江大学附属儿童医院)

国家科委、卫生部在有关实验动物管理法规中要求，清洁级以上实验动物大、小鼠应排除鼠支原体和肺支原体。

本文通过已建立，能同时检测支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR方法，检测清洁级和普通级大鼠、小鼠支原体和肺支原体的感染，了解和比较在不同生长环境下大鼠、小鼠支原体的感染情况。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级SD大鼠150只、ICR小鼠120只， C57小鼠100只，普通级SD大鼠104只、ICR小鼠97只，C57小鼠76只。

1.2标本DNA的获得 采集大鼠、小鼠、兔的鼻腔和气管标本各1份，加入生理盐水500 μL，震荡混匀，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入50 μL抽提裂解液混匀(10 mmol/L Tri-HCl，pH 7.6, 5 mmol/L EDTA，0.5% SDS),置100℃煮沸10 min, 12 000 r/min离心5 min，取3 μL上清液作为PCR模板。

每只大鼠或小鼠只要其中的一份标本呈阳性，即判定为阳性。

1.3TaqMan探针法支原体通用型和肺支原体特异型双通道荧光定量PCR法设计 PCR反应体系引物、探针由上海某生工生物工程有限公司合成，探针经高效液相(HPLC)纯化。目的片段160 bp。

双通道荧光定量PCR反应体系为25 μL，引物和探针浓度分别为0.4 μmol/L和0.2 μmol/L，荧光定量PCR反应液用2×荧光定量PCR 缓冲液(其中包括dNTP、MgCl2和热启动Taq酶等，大连某生物工程有限公司TAKARA提供)，上清液模板为3 μL，其余用ddH2O补足至25 μL。

采用ABI 7500仪器进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR反应循环和温度设置为94℃预变性2 min后，94℃、15 s，60℃、60 s为一个循环，共循环40次。

2 试验结果

清洁级SD大鼠150只、ICR小鼠120只，C57小鼠100只，普通级SD大鼠104只、ICR小鼠97只，C57小鼠76只的鼻腔和气管标本，进行支原体和肺支原体荧光定量PCR法检测。结果详见表1。

表1 鼠支原体和肺支原体感染情况检测结果

由表1可见，比较清洁级和普通级大鼠、小鼠支原体的总体感染情况，普通级大鼠、小鼠的总体感染率明显高于清洁级动物(X2=4.413,P=0.036)。

3 分析讨论

支原体感染可以引起实验动物大、小鼠的严重疾病。对实验动物有病原学意义的支原体包括肺支原体、溶神经支原体和关节炎支原体等。鼠肺支原体可以引起大、小鼠呼吸系统疾病，包括鼻炎、中耳炎、气管炎和肺炎。此外，还可能侵害生殖系统，引起母鼠产仔率下降。

随着分子生物学技术的发展和普及，PCR检测技术已体现出特异、灵敏、快速的优势。Goto等(1994)[1]用PCR法和分离培养法检测大鼠鼻腔、气管和咽拭子中的肺支原体，在鼻腔和气管中，PCR法的阳性率为62.9%和57.4%，而分离培养法的阳性率为55.5%和51.8%。Takahashi(2004)[2]根据肺支原体ITS 序列设计引物，检测灵敏度达10 pg/5 μL，通过Southern杂交可提高到100 fg/5 μL；荧光核酸酶PCR能检测到模板中10个DNA拷贝[3]，均显示了很高的敏感性。

本文采用能同时检测支原体和肺支原体的双通道荧光定量PCR方法，最低也可检测到10个肺支原体；且使用该法，只要通过一次荧光定量PCR，就能确认是否有支原体感染，达到了快速、敏感和定量的效果。结果表明，普通级大鼠、小鼠支原体的总体感染率明显高于清洁级大鼠、小鼠。在动物实验中应慎用普通级，使用清洁级实验动物时也应严格遵照实验要求。本试验所用的普通级大鼠、小鼠均来自清洁级大鼠、小鼠，只因实验需要，饲养在非屏障系统环境中。在清洁级大鼠中仍然发现1例支原体感染，说明在实验过程中，由于实验本身、药物、手术、人员进出、器械消毒等多因素的影响，容易受到支原体感染。尽管支原体具有致病性，但多数时候以隐性感染存在。这种隐性感染容易被忽视，从而严重影响实验结果，必须引起注意。

[1]Goto K, Kunita S, Terada E, Itoh T. Comparison of polymerase chain reaction and culture methods for detection of Mycoplasma pulmonis from nasal, tracheal and oral swab samples of rats[J].Jikken Dobutsu,1994,43(3):413-415.

[2]Takahashi-Omoe H, Omoe K, Matsushita S, Kobayashi H, Yamamoto K.Polymerase chain reaction with a primer pair in the 16S-23S rRNA spacer region for detection of Mycoplasma pulmonis in clinical isolates[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2004,27(2):117-128.

[3]Loganbill JK, Wagner AM, Besselsen DG.Detection of Mycoplasma pulmonis by fluorogenic nuclease polymerase chain reaction analysis[J].Comp Med,2005,55(5):419-424.