一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法
2011-10-16何冬兰余金龙邵坤彦邵洁云
何冬兰,余金龙,邵坤彦,邵洁云
(中南民族大学生命科学学院,武汉430074)
一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法
何冬兰,余金龙,邵坤彦,邵洁云
(中南民族大学生命科学学院,武汉430074)
依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.
碱裂解法;快检缓冲液;重组质粒
常规方法筛选阳性克隆通常是一项繁琐而耗时的工作.近年来,文献[1,2]研究了菌落PCR筛选重组克隆子的方法,即挑取单菌落作为模板进行PCR扩增,此法简便但费用较高;采用碱裂解菌液后直接进行琼脂糖凝胶电泳[3],通过检查质粒DNA有无滞后现象也可快速筛选出重组子,但条带较多不便观察;采用快检缓冲液的方法挑取单菌落进行电泳[4],可将重组子的筛选过程缩短至2 h内,提高了筛选效率,成本低,但操作过程中注意事项比较多.
笔者在运用快检缓冲液筛选重组克隆的过程中,从碱裂解法提取质粒DNA方法得到启发,将培养好的菌液经快检缓冲液裂解后,经过处理直接进行电泳筛选阳性克隆子,并验证其结果与菌液PCR、酶切筛选结果的一致与否.
1 材料和方法
1.1 菌株与载体
E.coliDH5α由本实验室保存,载体pMD18-T购自TaKaRa公司.外源片段为双生病毒卫星DNAβ,大小约为1.4 kb,片段的克隆由中南民族大学生命科学学院生物工程研究中心分子微生物实验室完成.
1.2 试剂
快检缓冲液的配制(50 mL),参照文献[4]方法:2.5mL 2mol/L N aOH;2.5mL 10%SDS;0.5 mL 0.5 mol/L EDTA;2.5 mL 1mol/L T ris-HCl pH 8.0;42 mL H2O.
1.3 快检缓冲液裂解菌液法筛选阳性克隆
从转化平板中随机挑取单菌落,接种于3mL液体培养基中(含有20μg/mL氨苄青霉素),37℃,250 r/m in振荡培养6~8 h后,取菌液1.5 mL加入到EP管中,12000 r/m in离心30 s,小心弃上清,向EP管中加入80μL快检缓冲液,振荡器上振荡2 m in后置于65℃水浴锅中温育5m in,室温冷却后,12000 r/m in离心5 m in,取上清5μL进行电泳检测,同时以自连载体或标准M arker为对照.
2 结果与分析
2.1 快检结果、菌液PCR以及酶切验证
从转化平板上随机挑取8个单菌落培养后经快检缓冲液裂解,电泳检测结果见图1.由图1可见:利用快检缓冲液法提取的重组质粒带型和用TaKaRa公司试剂盒提取重组质粒的结果一致.
图1 1.4 kb的外源片段连接在pMD18-T载体上的快检结果Fig.1 Electrophoresis results of the exogenous fragments(1.4 kb)connect w ith pMD18-T vector
2.2 菌液PCR鉴定
分别以菌液作为模板,以原扩增引物进行PCR验证,结果见图2.图2中,8号为对照,没有扩增出目的片段,快检为阳性的样品均扩增得到预期大小(约1.4 kb)目的片段.
图2 菌液PCR鉴定Fig.2 Detection of bacteria solution by PCR amplification
图3 质粒酶切结果Fig.3 Restriction enzyme disgestion of the recombinant plasm ids
2.3 重组质粒酶切验证
通过菌液PCR验证为阳性克隆,选取其中1号和3号管,进一步抽提质粒进行酶切验证,酶切结果显示,转化子质粒经B amH1和H indⅢ单酶切后,线性化亮带约在4.0 kb位置,载体pMD18-T约为2.7 kb,经过双酶切可以得到目的片段条带(约1.4 kb),通过验证,目的条带所在位置正确,转化子为含有目的插入片段的重组质粒.
3 讨论
1)在利用快检缓冲液裂解菌液后,将其置于65℃水浴锅中进行温育,当基因组DNA用RN ase A处理时,为避免在室温下RN ase A中混有的DN ase降解DNA,推荐选用65℃水浴,因为在该温度下,DN ase活性几乎丧失[5],而RN ase A活性依然很高,处理效果较好,减少背景干扰.经裂解后留在菌液中的为大肠杆菌染色体DNA和质粒DNA,而染色体DNA较大,经离心后,与菌体一起沉淀到下层,质粒DNA处于上清液中.
2)在运用快检缓冲液裂解菌液法进行阳性克隆筛选时,比较了裂解提取的质粒DNA与TaKaRa公司质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA,发现两者质粒带型一致,而用自配快检缓冲液裂解法操作步骤简单易行,方便省时,除了简化常规方法操作步骤外,其成本低廉,大幅度节省了试验费用,为质粒提取试剂盒的开发提供了一种很好的借鉴思路.
综上所述,使用快检缓冲液裂解菌液法筛选重组质粒切实可行,并有较好的重复性,为避免出现假阳性结果,最好设立对照以确保最终结果的准确性.由于样品仅需简单处理即可进行鉴定,从而避免原有方法在处理样品时必须提取质粒,PCR扩增和酶切鉴定等繁琐步骤,使得在筛选重组子的过程中,工作效率大为提高,并节约了实验室成本,是一种快速、简便筛选阳性克隆的好方法.
[1] 张传生,耿立英,杨娜娜,等.PCR快速筛选重组克隆方法的建立 [J].生物技术,2005,15(1):43-44.
[2] 陈书霞,王小武,房玉林,等.单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆 [J].微生物学通报,2006,33(3):52-56.
[3] 熊 敏,李 青,李文涵,等.一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法 [J].生物技术,2005,15(1):51-52.
[4] 张桂敏,刘 振,李春华,等.一种简便快速筛选重组子的方法 [J].湖北大学学报:自然科学版,2005,27(3):280-281.
[5] 张颖慧,魏东盛,刑来君,等.一种改进的丝状真菌DNA提取方法[J].微生物学通报,2008,35(3):466-469.
A RapidM ethod for Preparation of Plasm id DNA for Screen ing Recombinant Clones
H e D ong lan,Yu J inlong,S hao K unyan,S hao J ieyun
(College of L ife Science,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)
A ccording to themethod of screening recombinant clones by the specific lysis buffer in combination w ith the principle of the alkaline lysis extraction plasm id DNA,the bacterial solution was directly lysed in the specific lysis buffer for screening recombinant clones.This procedure el im inates the cumbersome steps of plasm id extraction and identification as well as that of PCR and plasm id DNA restriction enzyme disgestion.The method could screen recombinant clones rapidly.
alkaline lysis;specific lysis buffer;recombination clones
Q 753
A
1672-4321(2011)01-0037-02
2011-02-01
何冬兰(1964-),女,教授,研究方向:分子微生物学,E-mail:ymhlh@yahoo.com.cn
国家民委自然基金资助项目(PM ZY02002)