简易HPCE法分离检测扑尔敏对映异构体

沈静茹,林 敏,余学红,何本荣

(1中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,武汉430074;2中南民族大学校医院,武汉430074)

简易HPCE法分离检测扑尔敏对映异构体

沈静茹1,林 敏1,余学红2,何本荣1

(1中南民族大学化学与材料科学学院分析化学国家民委重点实验室,武汉430074;2中南民族大学校医院,武汉430074)

采用高效毛细管电泳(HPCE)法分离扑尔敏手性异构体,建立了简易HPCE法分离检测扑尔敏对映体含量的方法.在国产仪器上,以未涂层石英毛细管柱(75μm)、pH2.5、T ris-磷酸缓冲液(40mmol/L)、分离电压25 kV、进样时间1m in、检测波长214 nm、温度20℃条件下扑尔敏两对映体实现了基线分离,分离度可达10.64.扑尔敏消旋体浓度在0.001～0.10 mg/mL范围内,峰高、峰面积与浓度呈线性关系,峰面积线性关系好于峰高,两峰峰面积线性相关系数r可达0.99883和0.99128,前峰的峰高及峰面积精密度实验表明,RSD(5次)分别为7.97%和8.29%.在未构建其他手性环境的条件下,该方法使扑尔敏两对映异构体达到快速分离,据此建立的测定方法可用于实际样品的含量测定.

高效毛细管电泳法;分离;测定;扑尔敏手性异构体

目前,扑尔敏(又名马来酸氯苯那敏,或氯屈末通,或马来酸氯苯吡啶)作为一种优良的抗组胺药物,已被广泛应用于日常抗过敏、抗感冒治疗中.扑尔敏是手性药物,其中右旋扑尔敏的药理活性较外消旋体强,约为后者的2倍,副作用更轻微少见[1],进行扑尔敏手性异构体分离分析研究,对于控制扑尔敏药品质量,降低其潜在的毒副作用,具有重要意义.近年来扑尔敏对映体分离的文献报道主要集中于构建手性环境的方法,如构建HPCE流动相手性环境的添加β-环糊精的毛细管电泳-方波安培分离检测法[2]、环糊精衍生物做手性添加剂的毛细管电泳法[3-5]以及采用含有手性固定相或手性添加剂的高效液相色谱法分离扑尔敏对映体的工作[6].

本研究以国产HPCE仪、国产普通75μm未涂层石英毛细管柱、单一缓冲体系,不添加任何手性添加剂分离扑尔敏对映异构体.建立了无需营造额外手性环境,即不使用有填充物的手性电泳柱或在流动相中加添加剂的方式,仅凭借单一缓冲体系直接分离扑尔敏对映体,以达到理想的分离效果(未见文献报道),同时藉此可建立灵敏的、简易快速的两对映异构体含量测定的新方法.

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

1.1.1 仪器

CL 1020型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司、中国科学院研究生院应用化学所)、pHS-3C型酸度计(上海伟业仪器仪表厂)、融硅石英毛细管(75μm,I D,有效长度40 cm,永年光纤厂,河北省永年县)、0.22μm 微孔滤膜(上海市新亚净化仪器厂).

1.1.2 试剂

三羟甲基氨基甲烷(T ris)(上海山浦化工有限公司)、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、盐酸(信阳市化学试剂厂)、马来酸氯苯那敏片(上海皇象铁力蓝天制药有限公司,湖北华中药业有限公司,)、马来酸氯苯那敏对照品(含量99.7%、中国药品生物制品检定所)、超纯水,其他试剂均为分析纯.

1.2 前处理

1.2.1 药品处理

马来酸氯苯那敏片(4 mg/片)于少量无水乙醇中捣碎溶解,用超纯水稀释至不同浓度后过滤,马来酸氯苯那敏对照品(含量99.7%)用超纯水配置成0.016mg/mL过滤,配置不同浓度的T ris-磷酸缓冲液,按分离所需调pH值,所用溶液均用0.22μm 微孔滤膜过滤,作为电泳的运行介质.

1.2.2 高效毛细管电泳分析预处理

HPCE柱每次运行之前依次用0.1mol/L HCl、超纯水、背景电解质各冲洗6 m in.采取注射器压力进样1m in,分离电压为25 kV,检测波长214 nm,温度20℃.

2 结果与讨论

2.1 分离电压的变化对分离情况的影响

分离电压是影响分离的一个重要因素.在pH 2.5,浓度40 mmol/L T ris-磷酸缓冲液中,扑尔敏样品浓度0.016mg/mL、进样1m in、检测波长214 nm、20℃的电泳条件下,分别考察了20,23,24,25,26,27,30 kV时扑尔敏对映体的分离情况.

在国产仪器上,分离电压小于24 kV时,扑尔敏对映体得不到分离,显然此电压不能使两对映体产生分离;当分离电压大于27 kV时,扑尔敏对映体亦得不到分离或响应值很小(见表1).在分离电压为24,25,26 kV时扑尔敏两对映体洗脱强度大,基线平稳,且能达到基线分离,分离度也较大,故选择25 kV作为扑尔敏对映体分离的最佳电压条件.

表1 不同分离电压对扑尔敏对映体分离的影响Tab.1 Separation of chlorpheniram ine w ith different voltage

2.2 缓冲液pH值的变化对分离情况的影响

缓冲液的pH对分离有较大影响.当40 mmol/L T ris-磷酸为缓冲溶液、分离电压25 kV、检测波长214 nm、进样1 m in、20℃的电泳条件下,扑尔敏样品浓度为0.016 mg/mL.改变缓冲液的pH值(1.0～4.5范围),以考察对分离情况的影响.当缓冲液的pH＜2.4时,扑尔敏对映体得到部分分离;当缓冲液pH＞3.5时,扑尔敏对映体基本不分离,随着缓冲液pH的增大,出峰时间也呈逐渐拖后的现象;当缓冲液pH为2.5时,扑尔敏两对映体达到基线分离,说明缓冲液酸度对分离选择性起着决定性的作用,唯有此酸度条件下两对映体的表观淌度方有很大差异,达到了基线分离的分离效果.故选择缓冲液pH为2.5(见图1).

(A)pH 2.4;(B)pH 2.5;(C)pH 3.5图1 不同缓冲液pH下扑尔敏对映体分离图Fig.1 Separation of chlorpheniram ine w ith pH different buffer

2.3 缓冲液浓度的变化对分离情况的影响

在pH 2.5的T ris-磷酸缓冲液、分离电压25 kV、波长214 nm、进样1 m in、温度20℃的电泳条件下,扑尔敏样品浓度为0.016 mg/mL,改变缓冲液T ris-磷酸的浓度(分别为20,30,40,50,60 mmol/L),以其考察对分离情况的影响.在所有T ris-磷酸浓度条件下,扑尔敏两对映体其分离度均可＞10;当T ris-磷酸浓度＜40mmol/L,随着T ris-磷酸缓冲液浓度的增加,峰高、峰面积的响应值逐渐增大,两峰在40 mmol/L时的出峰时间最短,响应值最大(见图2);当T ris-磷酸浓度＞40mmol/L,其响应值反而逐渐减小,说明T ris-磷酸浓度为40mmol/L时该缓冲液对扑尔敏对映体的洗脱强度最佳,故选定40 mmol/L T ris-磷酸为扑尔敏对映体分离的最佳缓冲液浓度.

图2 不同浓度缓冲液对扑尔敏对映体分离度的影响Fig.2 Separation of chlorpheniram ine w ith different buffer concentration

2.4 方法评价与应用

2.4.1 扑尔敏对映体分离的线性范围

在最佳HPCE分离条件(pH 2.5、40 mmol/L tris-磷酸缓冲液、分离电压25 kV、检测波长214 nm、进样时间1 m in)下,配制不同浓度扑尔敏对照品溶液,得到扑尔敏对映体的电泳峰峰高、峰面积与浓度呈线性关系.其中,前峰在扑尔敏浓度0.001～0.10 mg/mL范围有线性相关性:峰高-浓度标准曲线方程为y= 2.71×104+6.97×106x,线性相关系数r=0.986 75;峰面积-浓度标准曲线方程为y=1.08×105+4.35×107x,相关系数r=0.99883;后峰在扑尔敏浓度0.001～0.10 mg/mL范围有线性关系:峰高-浓度标准曲线方程为y=6.82×104+6.66×106x,相关系数r=0.93677;峰面积-浓度标准曲线方程为y=1.54×105+5.87×107x,相关系数r=0.99128.

2.4.2 扑尔敏对映体分离的精密度实验

对同一扑尔敏对照品溶液(0.016 mg/mL)在上述优化的实验条件下,重复进样5次,测定峰高和峰面积,结果见表2.

表2 扑尔敏对照品精密度测定结果(n=5)Tab.2 Results of chlorpheniram ine standard precision determ ination(n=5)

2.4.3 不同生产厂家扑尔敏样品的分离分析

在优化的实验条件下,分别选取2种不同厂家生产的扑尔敏样品进行分析对比.分析结果见表3.由表3可知:2个不同厂家生产的扑尔敏片在此条件下,对映体均达到基线分离,其分离度分别为10.641和10.696.

表3 不同厂家生产的扑尔敏样的分离Tab.3 Enantiomeric separation of different manufacturers′chlorpheniram ine

3 结语

以未涂层融硅石英毛细管柱(75μm)、pH 2.5、T ris-磷酸缓冲液浓度40 mmol/L、分离电压25 kV、进样时间1 m in、检测波长214 nm 、温度 20℃ 为HPCE的最佳分离条件,建立了扑尔敏对映体拆分的高效毛细管电泳检测方法.对缓冲溶液的浓度、pH、分离电压及拆分效果的影响进行了讨论.并得到扑尔敏分离线性范围为0.001～0.10 mg/mL.采用HPCE测定扑尔敏各对映体的精密度,5次进样的前峰峰高、峰面积RSD分别为7.97%和8.29%,后峰峰高、峰面积RSD分别为9.15%和9.08%.同时分离了不同生产厂家的扑尔敏样品,均可得到分离度大于10的分离.本方法用于分离测定扑尔敏对映体,简便易行,结果稳定,可靠.

[1] 王世玉.世界手性药物选集[M].北京:中国医药科技出版社,1998:242-243.

[2] 唐亚军,谢天尧.扑尔敏对映体的毛细管电泳-方波安培分离检测[J].分析试验室,2002(5):79-81.

[3] 王 伟,张永利.毛细管电泳法手性分离5种碱性药物[J].药物分析杂志,2007,27:12.

[4] 夏 陈,夏之宁.基于非手性离子液体的毛细管电泳拆分3种手性药物[J].色谱,2008,26(6):677-681.

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[6] H iep Bui Tung,Khanh V u,Hung N guyen K im,et al. Determ ination of the enantiomers of chlorpheniram ine and its main monodesmethyl metabolite in urine using achiral-chiral liquid chromatography[J].Journal of Chromatography:B,1998,707:235-240.

A S implif ied High Performance Capillary Electrophoresis Separation and Determ ination of Chlorphen iram ine Enantiomers

S hen J ing ru1,L in M in1,Yu X uehong2,H e B enrong1
(1 Key L aboratory of A nalytical Chem istry of the State Ethnic A ffair Comm ission,College of Chem istry andM aterial Science,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China;2 Hospital,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

A s imple method of enantiomorph separation and determ ination of chlorpheniram ine by high performance capillary electrophoresis was investigated.The chlorpheniram ine enantiomers were well separated in the uncoated fused silica capillary column(75μm)under the follow ing conditions:pH2.5,T ris-phosphate buffer 40 mmol/L,separation voltage of 25 kV,20℃,injection t ime is 1 m in,detection wavelengthλof 214 nm.A good linear relationship was obtained between the peak height or peak area and chlorpheniram ine racemoid concentration the range of 0.001～0.10 mg/mL,the linear relationship coefficients(r)of peak areas is 0.99883 and 0.99128 for the first and second repectively and the relative standard deviations RSD(5 t imes)of the first peak height and peak area is 7.97%and 8.29%.

high performance capillary electrophoresis(HPCE);separation;determ ination;chlorpheniram ine enantiomers

O 652.63;O 641.6

A

1672-4321(2011)01-0025-04

2010-11-10

沈静茹(1966-),女,教授,研究方向:分离分析,E-mail:shenjingru519@hotmail.com

湖北省自然科学基金资助项目(95J60)