石见穿萃取物对体外培养成骨细胞活性的影响

王朝元,徐 宗

(中南民族大学生命科学学院,武汉430074)

石见穿萃取物对体外培养成骨细胞活性的影响

王朝元,徐 宗

(中南民族大学生命科学学院,武汉430074)

石见穿以95%乙醇抽提得总提物.分别用不同试剂萃取总提物,获得其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及其水溶性成分.以体外培养成骨细胞M C3T3-E1为模型,用cck-8法测定细胞增殖,碱性磷酸酶(AL P)试剂盒法测定了上述不同萃取物对成骨细胞增殖和分化的影响.结果表明:总提物在浓度10-3、10-4、10-5mg/mL时和10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物具有极显著的促进细胞增殖 (P＜0.01)作用.10-4mg/mL总提物和10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物显著促进成骨细胞AL P活性(P＜0.05).研究表明石见穿乙酸乙酯萃取物含有能促进成骨细胞增殖和成骨活性的有效成分.

石见穿;萃取物;成骨细胞;细胞增殖;成骨活性.

石见穿(S alvia chinensisBenth)为唇形科植物华鼠尾草的地上部分[1,2],作为常用草药,其名见于《本草纲目》仅有疗效记载,本品曾收载于《中国药典》(1997年版)一部,为中草药的一种.其疗效包括清热解毒,活血止痛等.在中医中可用于治疗急慢性肝炎[3]、肾炎、风湿骨痛、癌症[4]、面神经麻痹、白带、痛经[5]、淋巴结结核、乳腺炎、跌打损伤、蛇咬伤、痈肿热痛等症,尤其具有治疗骨病的疗效.李时珍在《本草纲目》卷二十一草部记载有石见穿用于治疗骨痛.中医临床研究证实其具有一定的治疗骨相关疾病的疗效,包括:治疗风湿骨痛,跌打损伤的疗效[2].但是,其何种成分对成骨细胞的增殖和成骨活性有促进作用还不明确.石见穿对成骨细胞的代谢的影响尚未见相关的报道.因此,本研究旨在通过分离石见穿的不同组分,研究其具有治疗骨病疗效的有效成分,以期进一步研究其作用机理[6-10].

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

石见穿药材采自湖北省利川县并保存于中南民族大学药学院标本馆,经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定确认后用于本实验.其它主要试剂:己烯雌酚(DES)(购自武汉银信);新生小牛血清(美国Gibco Corporation);DEM E培养基(新西兰HyClone Corporation)、胰蛋白酶(杭州吉诺公司);CCK-8(日本同仁化学公司);碱性磷酸酶(AL P)试剂盒(南京建成生物技术有限公司)、考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物技术有限公司).小鼠成骨样细胞系M C3T3-E1(购自中科院上海细胞研究所).

1.1.2 仪器

CO2培养箱(HF151UV CO2培养箱,上海力申科学仪器有限公司);XDS-1B型倒置生物显微镜(重庆光电仪器总公司);ELX808型酶标仪(美国Bio-Tek公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂).

1.2 方法

1.2.1 药物的制备

称取石见穿5 kg,经95%的乙醇浸泡24 h后过滤,残渣继续经95%的乙醇浸泡24 h,过滤,如此反复3次,合并滤液,减压回收溶剂获得浸膏189 g.浸膏用90%的甲醇溶液溶解,为总提物.部分总提物用石油醚萃取.溶液分为2层,上层为石油醚部位,减压回收得石油醚萃取物;下层部分用乙酸乙酯萃取.溶液分为2层,上层为乙酸乙酯部位,减压回收得乙酸乙酯萃取物;下层为水层加入等量正丁醇萃取,回收上层得正丁醇萃取物;下层为水部位,减压回收得水萃取物.

称取已经真空干燥后所得恒重的总提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水萃取物浸膏各0.01 g,加200μL DM SO 溶解,取其中100μL加入50mL培养基,用微孔滤膜过滤除菌,制成浓度10-1mg/mL药液.取此药液用培养基逐级稀释为10-2、10-3、10-4、10-5mg/mL不同浓度梯度备用.阳性对照:称取0.01 g己烯雌酚,用200μL DM SO 溶解,再以含10%小牛血清M EM 培养基稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mg/mL 过滤除菌备用. 阴性对照液:不加药的10% 小牛血清培养基.

1.2.2 细胞培养

用10%小牛血清的DM EM培养基培养M C3T3-E1细胞.细胞传代时,将长满M C3T3-E1细胞的培养瓶中的培养液倾倒,用PBS清洗2次,在培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL,消化2～3 m in,待大多数细胞变圆脱落,加入4 mL灭菌的10%的小牛血清和双抗的培养液终止消化.1500 r/m in离心沉淀细胞.

1.2.3 成骨细胞增殖实验

1)CCK-8法吸光度与细胞数目曲线测定.将收获的成骨细胞分别以密度0、0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104细胞/孔接种于96孔板培养24 h,每种处理设5个复孔.采用cck-8法[11],用酶标仪于450 nm处测定各孔的吸光度.

2)不同萃取物对成骨细胞增殖影响.按密度0.4×104细胞/孔接种于96孔板,培养24 h,换液,加入含相应萃取物的培养基100μL,每组设5个复孔.同时以不加药培养基为空白对照,以己烯雌酚为阳性对照.培养72 h后,向每孔加入10 μL cck-8,3 h时后测定OD值[11].

1.2.4 成骨细胞分化功能测定

1)AL P试剂盒标准曲线测定.细胞悬液分别以密度 0、0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104、3.2×104细胞/孔接种于96孔板,每孔设5个复孔,培养24 h,加0.1%T riton X-100/PBS液裂解细胞12 h,按AL P试剂盒介绍的方法测定成骨细胞的碱性磷酸酶的活性.

2)不同萃取物对成骨细胞活性的影响.细胞悬液按1×105细胞/孔密度接种于96孔板,培养24 h,更换含药培养基,每孔100μL,继续培养7 d后裂解细胞,按AL P试剂盒法于520 nm处测定吸光度,按考马斯亮兰法于595 nm处测定蛋白质含量(g/L).AL P活性以U/gprot表示.

1.2.5 统计方法

实验所得数据用SPSS10.0软件系统进行显著性差异分析处理,当P≤0.05,表示两者有显著差异;当P≤0.01,表示两者有极显著差异.

2 结果

2.1 石见穿萃取物对成骨细胞增殖的影响

2.1.1 CCK-8法线性关系考察

以5孔吸光度的平均值(y)与细胞数(x)作线性回归,得回归方程:y=0.2396x+2.5503(R2=

0.9981,n=5).由图1可见,在(0～1.6×104)细胞/孔范围内,细胞数与吸光度具有良好的线性关系.

y=0.2396x+2.5503;R2=0.9981图1 CCK-8线性关系Fig.1 L inear relationship between cell number and absorbance at 450nm in CCK-8 assay

2.1.2 不同萃取物对成骨细胞增殖的影响

以图1结果为基础,按0.4×104细胞/孔接种96孔板,并用萃取物处理细胞,结果见表1.由表1可知,10-3～10-5mg/mL总提物明显促进成骨细胞的增殖(P＜0.05);10-3～10-5mg/mL乙酸乙酯萃取物能极明显地促进成骨细胞的增殖(P＜0.01),增值率达到39%,正丁醇部位10-1、10-2、10-5能明显地促进成骨细胞的增殖(P＜0.05).且所有药物处理组的细胞增殖率均高于阳性对照组.

2.2 石见穿萃取物对成骨细胞活性的影响

2.2.1 AL P试剂盒法线性关系的考察

以5孔吸光度的平均值(y)与细胞数目(x)作线性回归,得回归方程:y=0.03955x+1.1067(R2=0.9741,n=5).由图2可见,在(0～ 3.2×104)细胞/孔范围内,细胞数与吸光度(AL P活性)呈良好的线性关系.

表1 各实验组对成骨细胞增殖的影响Tab.1 Effect of extracts on proliferation ofMC3T3-E1

图2 碱性磷酸酶试剂盒线性关系Fig.2 L inear relationship between ALP and cell numbers

2.2.2 石见穿萃取物对成骨细胞分化的影响

成骨细胞总蛋白测定结果见表2.以图2结果为基础,细胞悬液按1×105细胞/孔接种于96孔板,并用萃取物处理成骨细胞,结果见表3.由表3可知,10-3～10-5mg/mL 总萃取物,10-4～10-5mg/mL乙酸乙酯萃取物,10-3mg/mL正丁醇萃取物能明显提高成骨细胞AL P活性水平(P＜0.05),尤其10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物能极显著提高成骨细胞AL P活性水平(P＜0.01).其它萃取物对成骨细胞 的分化均无明显影响.

表2 细胞的蛋白质总量Tab.2 Total protein mass of cell

表3 石见穿对成骨细胞活性的影响Tab.3 Effect of extract on osteoblast activity

3 讨论

本研究首次以体外培养的成骨细胞M C3T3-E1为模型,研究了石见穿萃取物对骨细胞增殖和成骨活性的影响.结果表明石见穿的部分萃取物对成骨细胞均具有一定的促进增殖和成骨活性的影响.由此对于进一步研究石见穿治疗骨折药效的机理提供了基础.

研究结果表明,石见穿的多种萃取物对成骨细胞均具有一定的促进增殖的作用.其中,以乙酸乙酯萃取物的效果最好.一般乙酸乙酯萃取物的成分主要为黄酮类化合物,该类化合物已证实对骨折的愈合具有较好的促进作用.而骨折的愈合与成骨细胞的增殖和分化有密切关系.因此,笔者初步判断,石见穿的乙酸乙酯萃取物可能含有促进成骨细胞成骨活性的该类化合物.

碱性磷酸酶是成骨细胞活性的主要标志.在骨骼发育及骨折愈合等情况下,旺盛生长和分化的成骨细胞表现出强烈的碱性磷酸酶活性.与上述细胞增殖结果一致,石见穿的乙酸乙酯萃取物对成骨细胞碱性磷酸酶活性具有较强的诱导作用.

此研究初步证实了石见穿治疗骨折的药效,笔者下一步将进一步分离纯化石见穿的化学组分,分析各组分对成骨细胞的增殖和分化的影响,以期查明其治疗骨病的有效成分,为未来开发该药提供依据.

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Effects of Extract fromSalivia chinensisBenth on Proliferation and Activity of OsteoblasticMC3T3-E1 Cell in Vitro

W ang Chaoyuan,X u Zong
(College of L ife Science,South-centralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

S alivia chinensisBenth were extracted w ith different solvents and the effects of the extracts on the proliferation and differentiation of osteoblast were investigated.S alivia chinensisBenth was first extracted w ith 95% ethanol followed seperately by extracted w ith petroleum ether,ethylacetete or butyl alcohol.M C3T3-E1 osteoblast-like cellswere used as in vitro model to test the effects of different fractions on osteoblast proliferation and differentiation.It was found that the general extract of 10-3,10-4,10-5mg/mL and the ethylacetete fraction of 10-3mg/mL could st imulate cell proliferation(P＜0.01).M oreover,the general fraction of 10-4mg/mL and ethylacetete fraction 10-3mg/mL enhance alkaline phosphatase(AL P)activity of M C3T3-E1(P＜0.05). It is conclusion that the components in the ethylacetate fraction fromS alivia chinensisBenth can st imulate osteoblast proliferation and differentiation.

S alivia chinensisBenth;extract;osteoblast;proliferation;osteogenic activity

Q 949.777.6;Q 253

A

1672-4321(2011)01-0033-04

2010-10-10

王朝元(1964-),男,副教授,研究方向:生物医学工程,E-mail:wangcyscu2001@yahoo.com

湖北省自然科学基金资助项目(2009CDZ033)