超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中的三聚氰酸

牛之瑞，冯 雷，李 波，祝红昆，珠 娜，潘 媛

(云南省产品质量监督检验研究院，云南 昆明 650223)

超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中的三聚氰酸

牛之瑞，冯 雷，李 波，祝红昆，珠 娜，潘 媛

(云南省产品质量监督检验研究院，云南 昆明 650223)

建立奶粉中的三聚氰酸的超高效液相色谱-四极杆串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。样品经透析袋净化、反相液相色谱分离后进行质谱分析，在多反应监测模式(MRM)下进行特征母-子离子对信号采集。根据保留时间、母离子和两个特征子离子信息进行定性分析，以离子对m/z42.0进行定量。三聚氰酸的最低检测限(RSN=3)为100.0 μg/kg。在100.0～2000.0μg/L时峰强度与质量浓度的线性关系良好(r2≥0.9999)。在100.0、500.0、1000.0μg/kg 3个添加水平，三聚氰酸的回收率范围为87.5%～98.8%，相对标准偏差小于9%。结果表明，该法简单、灵敏，适用于奶粉中三聚氰酸的分析确证。

三聚氰酸；奶粉；超高效液相色谱-串联质谱联用

三聚氰酸(cyanuric acid，CA)又名氰脲酸，是氢氰酸(HOCN)的三聚体，分子式为C3H3N3O3，相对分子质量为129.07。三聚氰酸与三聚氰胺结构类似，因含氮量高，有人作为伪蛋白添加到食品中使用，且研究证据显示单独摄入三聚氰胺毒性较低，同时摄入三聚氰酸和三聚氰胺后会导致肾结石，国外已有报道乳制品中检出三聚氰酸[1]。目前，国内检测三聚氰酸的方法多为气质联用法[2]，需要进行衍生化后才能够上机检测，操作比较复杂。液相色谱法多采用正相色谱串联质谱方法检测三聚氰酸[3]。国外已经有一些关于三聚氰酸的液相色谱-质谱联用法检测法研究，但一般在预处理阶段均采用固相萃取小柱的方法，取得了比较好的效果，但普遍存在成本偏高，操作繁琐等缺点[4-15]。将奶粉溶解后经透析纸透析，用反相色谱串联质谱法检测，取得了较好的检测结果，找到了一个操作简便且成本相对低廉的三聚氰酸检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶粉 市售。

三聚氰酸标样 美国Sigma公司；乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司；18.2M Ω超纯水 德国赛多利斯公司；透析袋 上海Green Bird公司。

1.2 仪器与设备

CPA225D电子天平 德国Sartorius公司；ACQUITY超高效液相色谱、ACQUITY UPLC HILLIC(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱 美国Waters公司；API-3200串联质谱仪、Analyst质谱工作站 加拿大AB公司。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 色谱

流动相A为10mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度见表1。流速：0.3mL/min；进样量5μL；柱温：3 0℃。

表1 三聚氰酸的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of cyanuric acid

1.3.2 串联质谱

UPLC-MS/MS接口为电喷雾接口(ESI)负离子模式，离子监测模式为多反应监测模式(MRM)，喷雾电压(IS)-4500V，喷雾气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)、碰撞气(CAD)均为高纯氮气，喷雾气气压为60psi，辅助气气压为65psi，气帘气气压为20psi，碰撞气气压为5psi，辅助喷雾气温度为600℃，去簇电压(DP)为－32.0V，入口电压(EP)为－8.0V，其他参考条件参见表2。

表2 三聚氰酸定性离子对、定量离子对、采集时间、碰撞能量和碰撞室出口电压Table 2 Qualitative ion pair, quantitative ion pair, harvest time,collision energy and collision cell exit voltage of cyanuric acid

1.4 标准溶液的配制

准确称取三聚氰酸标准品0.0100g于10mL容量瓶中，用乙腈-水(1:1)稀释至刻度，得到1.0mg/mL储备溶液，于－5℃避光保存。临用前，用流动相逐级稀释成所需浓度，添加到阴性样品中，然后进行样品前处理。

1.5 样品前处理

称取2g样品(精确到0.01g)于10mL离心管中，加入约60℃温水，立即旋涡混匀，冷却至室温，转移至折叠好的透析袋中，用5mL水分两次洗涤离心管，一并加入到透析袋中，将袋口扎紧，置于50mL烧杯中，加入10mL水透析，用保鲜膜将烧杯口密封，60℃水浴3h，然后室温放置13h后精确吸取透析液5mL于10mL容量瓶中用乙腈定容，经0.45μm滤膜过滤后进样。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

三聚氰酸溶于热水，采用透析的方法，直接用水在60℃条件进行提取，用保鲜膜将烧杯口封严，尽量减少水分蒸发带来的误差。如果采用透析液直接进样，色谱柱对水相十分敏感，出峰时间会发生漂移，无法达到检测要求，所以，取5mL提取液用乙腈定容至10mL后进样。基质标准曲线法，可以较好的减少因回收率问题带来的误差。

2.2 MS/MS条件和解离机理

图1 三聚氰酸一级质谱图Fig.1 Primary mass spectrum of cyanuric acid

图2 三聚氰酸二级质谱图Fig.2 Secondary mass spectrum of cyanuric acid

欧盟在EC/657指令中规定，利用质谱方法对药物残留进行确证，必须满足4个识别点的要求，同时特征离子的丰度比要和标准物质基本一致。采用串联质谱，一个母离子(图1)加两个特征离子(1.5点×2)可满足确证需要。三聚氰酸二级质谱的特征离子对分别为m/z127.9/42.0、127.9/84.8(图2)；加标样品中残留物的特征离子丰度与标准物质基本一致，标准物质定量离子色谱图见图3。

图3 三聚氰酸标样(5.0ng/mL)定量离子色谱图Fig.3 Quantitative ion chromatograph of chloramphenicol standard(5.0 ng/mL)

2.3 线性范围、标准曲线和检出限

采用基质标准曲线，稀释倍数为20倍。三聚氰酸在100～2000 μ g/kg(经样品前处理后溶液中的质量浓度为5.0～100.0μg/L)内线性良好，线性方程为y=67.8x＋70.7，相关系数为0.9999；根据信噪比(RSN)=3计算，仪器检出限为5.0μg/L，样品检出限为100μg/kg。

2.4 回收率和精密度

三聚氰酸样品添加实验选择100.0、500.0、1000.0 μg/kg，3个添加水平进行加标回收，以离子对m/z127.9/42.0进行定量。由表3可见，三聚氰酸的回收率范围为87.5%～98.8%，相对标准偏差小于9%。

表3 方法精密度和回收率(n＝4)Table 3 Precision and recovery rate of this method (n＝4)

2.5 实际样品检测

图4 加标奶粉样品定量离子色谱图Fig.4 Quantitative ion chromatograph of spiked milk powder sample

按照本方法对实际样品进行分析，从图4可以看出，样品中的三聚氰酸很好地被分离，无干扰峰，且分析时间很短。

3 结 论

本方法采用透析的方法对奶粉样品进行处理，超高效液相色谱-串联质联用方法检测奶粉中的三聚氰酸。本方法具有分析速度快、操作简单、成本低廉、高选择性和高灵敏度的特点，适合大量样品的快速分析要求。

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Determination of Cyanuric Acid in Milk Powder by UPLC-MS/MS

NIU Zhi-rui，FENG Lei，LI Bo，ZHU Hong-kun，ZHU Na，PAN Yuan
(Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Kumming 650223, China)

An ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of cyanuric acid residues in milk powder. Samples were thoroughly suspended in 60 ℃water and dialyzed against deionized water for 3 h in 60 ℃ water bath before analysis on reversed-phase high performance liquid chromatography-quadrupole tandem mass spectrometry. Mass spectral acquisition was applied with a multiple reactionmonitoring (MRM) mode. Qualitative analysis was achieved on the basis of the retention time and information about parent ions and two daughter ions. Quantitative determination was carried out on the basis of the characteristic ion ofm/z42.0. The linear range for cyanuric acid was between 5μg/L and100μg/L with a correlation coefficients (r2) of larger than 0.9999. The average recovery rate for cyanuric acid ranged between 87.5% and 98.8% in milk powder samples spiked at the levels of 100.0, 500.0 μg/kg and 1000.0μg/kg. The relative standard deviation (RSD) was less than 9%. The detection limit of this method was 100.0μg/kg.Therefore, this method is simple and suitable for routine analysis of milk powder.

cyanuric acid；milk powder；UPLC-MS/MS

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0173-03

2010-04-20

牛之瑞(1982—)，男，助理工程师，硕士，研究方向为农、兽药残留检测。E-mail：bull.nzr@163.com