复合酶水解猪血红蛋白制备富血红素多肽

杨万根，王卫东，孙会刚，马美湖

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

复合酶水解猪血红蛋白制备富血红素多肽

杨万根1，王卫东1，孙会刚1，马美湖2

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

以木瓜蛋白酶和AS1398中性蛋白酶组成的复合酶对猪血红蛋白进行水解，制备富血红素多肽，考察底物质量分数、加酶比例、水解pH值和水解温度等因素对水解率、蛋白质回收率、血红素含量等指标的影响。结果表明：底物质量分数是影响水解率和蛋白质回收率指标的最重要因素；pH值是影响血红素含量指标的最重要因素；复合酶水解猪血红蛋白制备富血红素多肽的最佳工艺条件为底物质量分数6%、pH8、水解温度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。在此工艺条件下，猪血红蛋白水解产物具有较高的蛋白质回收率和血红素含量。

猪血红蛋白；血红素；多肽；复合酶；水解

我国生猪产量排名世界第一位，每年屠宰场产生的绝大多数猪血不经利用而被直接排放入环境中，造成了严重的环境污染。而猪血富含蛋白质，其中的血红蛋白由珠蛋白和血红素两部分构成，是猪血中重要的营养成分。研究证明，猪血红蛋白多肽具有降血压[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]和增强人体免疫力[4]等多种生物活性，而血红素或血红素肽则是一种优质的补铁营养成分，与硫酸亚铁补铁剂相比，血红素铁的生物利用率高出23%[5]。因此，酶法水解猪血红蛋白开发富血红素多肽产物具有良好的经济价值和重要的环保意义。由于血红蛋白分子结构致密，以及蛋白酶具有底物专一性，所以为获得较好的水解效果，在实际生产中往往采用复合酶水解蛋白质。本实验对木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行复配，研究复合酶水解猪血红蛋白的最佳工艺条件，为富血红素多肽产品的生产提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粗血红蛋白，自制：新鲜猪血抗凝处理，纱布过滤除去纤维蛋白，4000r/min离心15min，用生理盐水清洗沉淀物，同样转速离心15min，重复两次，沉淀物冷冻备用；木瓜蛋白酶(77.9kU/g蛋白质) 广州远天酶制剂厂；AS1398中性蛋白酶(25.7kU/g蛋白质) 房山酶制剂厂；血红素标准品(相对分子质量651.96) 美国Sigma公司；L-半胱氨酸盐酸盐、EDTA、柠檬酸钠、甲醛、氢氧化钠、磷酸氢二钠、硫酸铜 国药集团(上海)化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；754型分光光度计 上海分析仪器厂；JB300-D型强力电动搅拌机、DS-1型组织捣碎机 上海标本模型厂；PHS-3C型pH计 上海精密仪器仪表有限公司；LD5-2型医用离心机 北京京立离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猪血红蛋白水解液的制备工艺

用适量水稀释猪血红蛋白解冻液，85℃恒温30min变性，捣碎，加水调节至预定质量分数的底物(蛋白质)浓度，加热至水解温度并调节至水解pH值，然后加入4000U/g蛋白质的复合蛋白酶水解，水解过程中用pH计测定pH值，并滴加碱液保持pH值不变。水解10h后，调pH4.5，90℃加热30min灭酶。4000r/min离心20min所得上清液即为猪血红蛋白水解液。

1.3.2 试验设计

采用L9(34)正交试验[6]研究底物质量分数、加酶比例(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)、水解pH值和温度4种因素对水解率、蛋白质回收率和血红素含量等指标的影响。试验因素水平表见表1。以最佳工艺条件进行验证实验。

表1 富血红素多肽制备工艺正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.3 指标测定

酶活：Folin-酚法[7]；氨基氮含量：甲醛滴定法[8]；总氮含量：微量凯氏定氮法[8]；血红素含量：分光光度法[9]。

1.3.4 水解率的计算

1.3.5 蛋白质回收率的计算

2 结果与分析

2.1 水解率的考察

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Orthogonal array design scheme, experimental results and range analysis

由表2极差分析可知，各因素对水解率指标的重要性为底物质量分数(A)＞温度(D)＞pH(C)＞加酶比例(B)。各因素对水解率的影响如图1所示，其中，底物质量分数各水平的优劣为6%＞8%＞10%，随底物质量分数增加，水解率下降；pH值各水平的优劣为7.0＞7.5＞8.0，随pH值增大，水解率下降；温度各水平的优劣为55℃＞50℃＞45℃，随温度升高，水解率增大；加酶比例以7:3的水解率最高，而比例9:1的水解率最低。所以，对水解率指标来说，最佳因素水平组合是底物质量分数6%、pH7、水解温度55℃、加酶比例7:3(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

图1 各因素对水解率的影响Fig.1 Effect of each factor on hydrolysis degree of porcine hemoglobin

随底物质量分数的升高，底物的流动性变差，在10%的底物质量分数时底物的流动性最差，不利于酶连续水解底物蛋白质，所以随底物质量分数升高，水解率下降。木瓜蛋白酶主要作用于蛋白质分子内部的肽链，将蛋白质分子内部的肽键切开，生成相对分子质量较大的肽段；AS1398蛋白酶则是一种微生物来源的水解酶，其水解专一性不强，水解产物以游离氨基酸和小肽为主，因此加酶比例9:1(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)的产物中的氨基氮含量比加酶比例7:3(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)产物中氨基氮含量低，故而水解率值小。董清平等[10]在比较碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解猪血能力时发现，中性蛋白酶水解猪血产物的三氯乙酸可溶氮量大于木瓜蛋白酶水解产物的三氯乙酸可溶氮量，说明形成的游离氨基酸和小肽数量大于木瓜蛋白酶水解产物。因此，与木瓜蛋白酶相比，AS1398中性蛋白酶更有利于提高水解率指标。

2.2 蛋白质回收率的考察

表2中的R值显示，各因素对蛋白质回收率指标的重要性为底物质量分数(A)＞pH(C)＞温度(D)＞加酶比例(B)。各因素对蛋白质回收率的影响见图2，图中显示底物质量分数6%蛋白质回收率最高，底物质量分数10%蛋白质回收率最低，原因也与底物流动性有关，底物质量分数大时底物流动性差，不利于酶的作用；pH值各水平的优劣为7.5＞7.0＞8.0，pH7.5为最佳水平是因为pH7.5为中性蛋白酶的最适水解pH值[11]，在最适水解pH条件下中性蛋白酶的酶活最高，水解产生的可溶肽段数量最多。温度各水平的优劣为55℃＞45℃＞50℃，以55℃为最佳水平，这是因为在该温度下，两种酶的反应速度最快。加酶比例各水平的优劣为5:5＞7:3＞9:1。可以看出，随中性蛋白酶在复合酶中所占的比例增大，蛋白质回收率增大，这是由于中性蛋白酶的水解产物主要是可溶性的小肽和游离氨基酸组成，随中性蛋白酶所占比例增大，水解物中可溶性小肽和游离氨基酸增多。因此，对蛋白质回收率指标而言，最优水平组合是底物质量分数6%、pH7.5、温度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

图2 各因素对蛋白质回收率的影响Fig.2 Effect of each factor on protein recovery rate

2.3 血红素含量的考察

由表2R值可知，pH值对血红素含量指标的影响最大，各因素对血红素含量指标的重要性为pH(C)＞温度(D)＞底物质量分数(A)＞加酶比例(B)。各因素对血红素指标的影响如图3所示。pH值各水平的优劣为8.0＞7.5＞7.0，温度各水平的优劣为55℃＞50℃＞45℃，底物质量分数各水平的优劣为8%＞10%＞6%，加酶比例(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)各水平的优劣为5:5＞9:1＞7:3。血红素含量随pH值的升高而逐渐增加，原因是随pH值升高，蛋白质带净电荷数增加，静电排斥力使蛋白质分子展开，原来埋藏在血红蛋白分子内部的血红素暴露出来，与血红素连接的肽链被酶水解的机会增加。李斌等[12]研究复合酶(中性蛋白酶:木瓜蛋白酶)水解猪血制备血红素的最佳工艺条件时发现，复合酶的最佳水解温度56℃，最佳加酶比例(中性蛋白酶:木瓜蛋白酶)0.98:1，与本实验结果基本一致。孙骞等[13]研究血红蛋白酶法脱色时发现，木瓜蛋白酶水解液的色泽比AS1398中性蛋白酶水解液浅，说明木瓜蛋白酶从猪血红蛋白中释放血红素的能力比中性蛋白酶差。本实验结果表明，中性蛋白酶所占比例最高时，血红素含量最高，也说明中性蛋白酶释放血红素能力比木瓜蛋白酶强。所以对血红素指标而言，最优水平组合为pH8.0、温度55℃、底物质量分数8%、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

综合考虑，由于对水解率和蛋白质回收率指标而言，pH值是非重要因素，为提高血红素含量，以pH8作为复合酶的最佳pH值；底物质量分数6%为水解率、蛋白质回收率两指标的最佳水平，而对血红素含量指标，底物质量分数3水平之间效果相差不大，因此以6%为复合酶的最佳底物质量分数；对水解率、蛋白质回收率和血红素含量3个指标而言，温度55℃都是最佳温度；对蛋白质回收率和血红素含量指标，加酶比例3水平之间效果相差不大，因此以水解率指标的最佳加酶比例为复合酶的最佳比例，即5:5(木瓜蛋白酶:中性中性)。因此，复合酶水解猪血红蛋白制备富血红素多肽的最佳工艺条件为底物质量分数6%、pH8、水解温度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。验证实验结果为产物的水解率17.5%，蛋白质回收率59.2%，血红素含量2.8mg/L。

图3 各因素对血红素含量的影响Fig.3 Effect of each factor on heme content

3 结 论

对影响水解率、蛋白质回收率和血红素含量3个重要指标的影响因素进行了研究，得到富血红素多肽产物的最佳制备工艺。结果发现，对水解率指标，各因素的重要性为底物质量分数(A)＞温度(D)＞pH(C)＞加酶比例(B)；对蛋白质回收率指标，各因素的重要性为底物质量分数(A)＞pH(C)＞温度(D)＞加酶比例(B)；对血红素含量指标，各因素的重要性为pH(C)＞温度(D)＞底物质量分数(A)＞加酶比例(B)。综合考虑，复合酶水解猪血红蛋白制备富血红素多肽的最佳工艺条件为底物质量分数6%、pH8、水解温度55℃、加酶比例5:5(木瓜蛋白酶:中性蛋白酶)。

[1] WEI J T, CHIANG B H. Bioactive peptide production by hydrolysis of porcine blood proteins in a continuous enzymatic membrane reactor[J].J Sci Food Agri, 2009, 89(3): 372-378.

[2] CHANG C Y, WU K C, CHIANG S H. Antioxidant properties and protein compositions of porcine haemoglobin hydrolysates[J]. Food Chem, 2007, 100(4): 1537-1543.

[3] NAMA N A, VRONIQUE D D, ADJE E Y, et al. Bovine hemoglobin:An attractive source of antibacterial peptides[J]. Peptides, 2008, 29(6):969-977.

[4] 李艳伟, 江波, 佟祥山. 酶解猪血蛋白中活性肽的纯化和功能研究[J]. 高等学校化学学报, 2005, 26(1): 61-63.

[5] ADRI?N G Q G, GUILLERMINA G R, JONATHAN S M, et al.Bioavailability of heme iron in biscuit filling using piglets as an animal model for humans[J]. Int J Biol Sci, 2008, 4(1): 58-62.

[6] 王钦德, 杨坚. 食品试验设计与统计分析[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2003.

[7] OWUSU-APENTEN K R. Food protein analysis[M]. New York: Marcel Dekker Inc., 2002: 70-71.

[8] 张意静. 食品分析技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2001.

[9] 王光亚. 保健食品功效成分检测方法[M]. 北京: 中国轻工业出版社,2002.

[10] 董清平, 方俊, 蒋红梅, 等. 猪血红蛋白的酶解及氨基酸含量的研究[J]. 现代生物医学进展, 2008, 8(7): 1259-1261.

[11] 张华山. 猪血蛋白的酶水解及氨基酸含量[J]. 氨基酸和生物资源,1999(3): 35-37.

[12] 李斌, 章梁, 黄泽元. 复合酶水解猪血工艺条件优化研究[J]. 粮油食品科技, 2009, 17(6): 51-53; 59.

[13] 孙骞, 于雪初, 胡鑫, 等. 血红蛋白酶法脱色技术研究[J]. 肉类研究,2008, 22(11): 32-34.

Preparation of Heme-rich Polypeptides from Porcine Hemoglobin by Enzymatic Hydrolysis

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Hui-gang1，MA Mei-hu2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In order to prepare a heme-rich polypeptide product, mixed papain and neutral protease were used for the hydrolysis of porcine hemoglobin. The effects of substrate concentration, mixing ratio for papain and neutral protease, hydrolysis pH and hydrolysis temperature on hydrolysis degree, protein recovery rate and heme content were investigated. The results indicated that substrate concentration was the most important factor that affects hydrolysis degree and protein recovery rate. pH was the most important factor that affects heme content. The optimal hydrolysis conditions for the preparation of heme-rich polypeptide products were substrate concentration of 6%, pH 8, hydrolysis temperature of 55 ℃ and papain-to-neutral protease ratio of 5:5. Under the optimal preparation conditions, relatively high protein recovery rate and heme content for the hydrolysis of porcine hemoglobin were achieved.

porcine hemoglobin；heme；polypeptide；enzyme complex；hydrolysis

TS251.93

A

1002-6630(2011)06-0007-04

2010-04-24

国家自然科学基金项目(30270976)

杨万根(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：yangwangen08@163.com