三角褐指藻提取生物柴油的生态响应研究

何 峰， 傅鹏程， 徐春明

（中国石油大学（北京）新能源研究中心，北京102249）

三角褐指藻提取生物柴油的生态响应研究

何 峰， 傅鹏程＊， 徐春明

（中国石油大学（北京）新能源研究中心，北京102249）

为了考察光暗对比以及不同碳源类型和浓度对于三角褐指藻生化物质的影响，用含有葡萄糖、乙酸钠和甘油的培养基对三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）进行培养，并测定生物量、细胞浓度、生化物质以及脂肪酸含量。结果表明，三角褐指藻具有光自养和兼养生长的能力；三角褐指藻对底物浓度与有机碳源具有选择性，其中利用葡萄糖的最佳浓度为20mmol/L；在500mL三角瓶培养过程中生长适宜条件为：温度（25±1）℃，光强25 μmol/（m2·s），pH为7.5。不管哪种碳源均能够促进三角褐指藻生物量的积累。将细胞浓度达到2.5×106个/mL培养末期的藻液进行蛋白质、还原糖、叶绿素以及总脂（TOL）含量分析，考察不同生长条件下生化物质的积累以及细胞生物量的变化。通过超声波萃取及索氏抽提总脂，质量分数达到20%（干重）；利用GC－MS分析脂肪酸含量及组成，其中以C16∶1，C16∶0居多，质量分数分别为34.8%，11.9%，可以用于提取生物柴油。

三角褐指藻； 有机碳源； 光暗对比； 葡萄糖； 生物量； 总脂含量； 生物柴油

微藻是一类具有生产高附加值化学和营养品如多不饱和脂肪酸（PUFAs）和生物活性成分的有潜力的资源［1］。同时做为原料生产生物柴油等生物质燃料受到国内外广泛关注，微藻因其具有生长速度快、脂肪酸含量高、生长条件温和、不受水质、自然环境等影响而被认为是值得推广的第三代生物质燃料。硅藻三角褐指藻富含油脂（占细胞干重40%～60%）［2］，且短链脂肪酸（C14和Cl6）占细胞中总脂肪酸的67%～70%［3］。

三角褐指藻富含大量的多不饱和脂肪酸和色素等，如二十碳五烯酸（EPA），具有很高的经济利用价值［4］。也有报道称国外已用三角褐指藻生产抗氧化剂（岩藻黄素）等产品［5］，关于它的研究国内进行了大量的工作，如对温度、光强、时间、营养盐及微量元素等进行了探讨。暨南大学段舜山课题组分别利用不同氮源［6］、不同铁浓度诱导海洋三角褐指藻的生长进行了研究［7］，梁英等［8］研究了温度对于三角褐指藻叶绿素荧光特性以及生长的影响，也有研究利用不同温度考察三角褐指藻的生长以及甘油三酯的积累情况，并且利用絮凝法收集藻种，提高了藻种的收集效率，另外，海洋微藻在受到环境胁迫后，如氮限制［9－12］、超声波、紫外光等对微藻的化学组成也产生了很大的影响［13］。目前已经有许多报道藻类的兼养培养比光自养培养生长速度快。例如在户外管式反应器中以0.1mol/L葡萄糖为底物兼养培养小球藻白天最高产量达到10.2g/（L·d），晚上达到5.9g/（L·d），比正常情况下小球藻类似的光自养产量要高三倍。兼养培养是光自养生产生物质的一种转换，生长速率及生物量的增加是光和无机物作用的结果。然而目前国内对于硅藻三角褐指藻在油脂积累以及代谢方面的研究较少，本研究以大规模培养三角褐指藻并且分析其脂肪酸含量及组成为目标，采用兼养培养的方式是目前研究较少的培养方式，因其高效且脂肪含量相对较高而体现了创新性与可操作性。

1 实验部分

1.1 材料与方法

1.1.1 藻种来源 中国科学院海洋研究所购得三角褐指藻藻种。

1.1.2 培养条件 人造海水配置f/2培养基配方为：NaNO3，74.8mg；NaH2PO4，4.4mg；Na2SiO3·9H2O，8.4～16.7mg；f/2微量元素溶液，1mL；f/2维生素溶液，1mL；海水，1 000mL。其中f/2微量元素溶液基本配方为：ZnSO4·4H2O，23mg；MnCl2·4H2O，178mg；CuSO4·5H2O，10mg；FeC6H5O7·5H2O，3.9g；NaMoO4·2H2O，7.3 mg；CoCl2·6H2O，12mg；Na2EDTA，4.35g。f/2维生素溶液基本配方：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水，1 000mL。盐度3%，pH＝7.5，藻种密度0.15g/L，光照培养箱25℃，光照5 000lux，光照时间为16h（暗反应时间为8h），培养14d，同时进行暗反应对照。对数生长期的藻种进行接种，每组实验3个平行，每天定期摇动3次，并随机变换位置，使吸收光照均匀。所有实验均在中国石油大学（北京）光合资源化利用实验室开展。

1.1.3 仪器设备 紫外分光光度计（Unico上海科学仪器厂）；高速冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器厂）；光照培养箱（上海科学仪器厂）；超声波破碎仪（上海德强医学仪器公司）；光强测定仪（LI－250）；超净工作台（哈东联科学仪器厂）；磁力搅拌器（江苏太仓科学仪器厂）；恒温摇床（江苏太仓科学仪器厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 收集培养 采用500mL的摇瓶进行培养，同时后期利用10L光合生物反应器进行扩大培养，收集培养至对数生长末期的藻液5 000g，4 000r/min离心10min，收集藻细胞，蒸馏水洗涤3次，收集藻粉，烘干，于－20℃冰箱保存备用。

1.2.2 生物量的测定 采用干重法测定。将恒重的滤膜抽滤一定体积的藻液，80℃恒温烘干24h，测定质量无变化后测定滤膜的质量差，即可获得细胞的生物量。

1.3 还原性糖、叶绿素a以及蛋白质含量的测定

1.3.1 还原性糖测定 采用DNS，每两天测定一次485nm下的吸光度，通过查找标准曲线对应的数值来确定还原糖类的变化。同时考察不同糖类在代谢过程中底物的消耗情况。

1.3.2 叶绿素a含量的变化 收集经4 000r/min，离心5min后所得到的藻种，冻干24h，用质量分数为90%丙酮进行萃取，叶绿素是一种检测光合效率的手段，叶绿素荧光分别在645nm和663 nm处有最大吸收，质量浓度＝（2 0.2×OD645＋8.02×OD663）×稀释倍数［15］。

1.3.3 蛋白质的测定

（1）细胞内蛋白质的提取：用带刻度的离心管量取一定体积的藻液，在5 000r/min下离心10 min，小心吸取上清液，余下的藻泥用蒸馏水定容至10mL，用超声波细胞粉碎仪进行细胞破碎，5 000 r/min下离心10min，将上清液移入比色管中，即得蛋白质提取液。

（2）细胞内蛋白质的测定方法：细胞内蛋白质的含量用紫外吸收法测定。取蛋白质的提取液置于光径1cm的石英比色杯中，测定其在280nm和260nm的波长，分别读取。用蒸馏水做空白对照。根据下列公式计算藻液中的蛋白质质量浓度：质量浓度＝1.55A280－0.76A260，根据藻液的浓缩比和对应生物量计算出蛋白质质量浓度。

1.3.4 总脂含量的测定 将收集的藻种进行离心烘干，分别取0.5g干藻种用正己烷进行萃取，后将藻种进行超声波破碎5min，并导入新的离心管，用N2吹干正己烷，称重计算总脂的含量。

1.4 脂肪酸的提取

在螺口试管中称取烘干的藻粉5 0mg，加入2.0mL的质量分数2%的H2SO4甲醇溶液，充入氮气。将螺口试管放入80℃砂浴1h，冷却至室温，分别加入10mL的蒸馏水和1.0mL的正己烷，充分振荡，4 000r/min离心5min。取出正己烷层放置到一小玻璃瓶中，氮气吹干，加入100μL正己烷。转移到另一个小玻璃瓶中，封口备测。

1.5 脂肪酸组成的测定

利用Finnigan Trace DSQ气质联用仪分析脂肪酸组成以及含量。毛细管色谱柱HP－5（30m×320μm×0.25μm，质量分数5%的苯酚）。进样口温度为270℃，扫面范围50～600u；55℃保持1 min，以30℃/min的速度升至175℃，以2℃/min的速度升至240℃，再以6℃/min的速度升至300℃，在300℃保持10min。离子源为电子轰击源（EI，70eV），载气为高纯氦气，流速1mL/min，以面积归一化法得到各脂肪酸组分的相对百分含量。

2 结果与讨论

2.1 藻类细胞密度以及生物量的变化

2.1.1 不同有机碳源对藻类生长的影响

（1）细胞密度的变化

各对照组均以0.15g/L的藻密度进行接种。在不同的有机碳源以及不同浓度下进行对照试验，以不加有机碳源的光反应为对照组，同时考察暗反应条件下，藻液的生长情况，如图1所示。

从图1（a）中可以看到随着时间的变化，细胞生物量呈线性增加，不同的葡萄糖浓度对于藻类细胞密度的影响有所不同，其中20mmol/L的葡萄糖浓度最适合藻细胞密度的增加，从5～100mmol/L的趋势内变化显著。图1（b）中含5～50mmol/L的乙酸钠的培养基对细胞生物量的增加均有显著提高，并且随着时间的变化成线性趋势，当乙酸钠浓度达到100mmol/L时，细胞密度变化很小，说明该浓度会抑制细胞的生长，而5mmol/L乙酸钠满足生长需求。图1（c）中添加不同甘油均使藻细胞在兼养条件下细胞密度有所提高，但是不同的添加浓度对于细胞密度的增加趋势变化不明显。图1（d）中将光反应与暗反应进行对比发现，在黑暗胁迫条件下，细胞的生长受到了严重抑制，细胞密度变化很小，因此说明黑暗条件不适合三角褐指藻的生长，而光自养与光兼养均能适合三角褐指藻生长。

Fig.1 Effect of algae cell density with different organic carbon source图1 不同有机碳源对藻类细胞密度的影响

（2）藻种的生物量变化

培养到第14d时，通过干重法测定细胞的生物量，结果如表1所示。

在25℃，每天光照16h的500mL培养瓶中进行自养、异养、以及兼养培养的对比，发现两组对比试验中添加有机碳源其生物量均有增加，并且在光兼养条件下生物量增加显著，最高可达到1.001 mg/mL。

表1 正常光照条件以及暗反应条件下细胞生物量的积累Table 1 Biomass of microalgae between normal and darkness mg/mL

2.2 细胞内生化物质及生化组成的变化

细胞内生化物质随时间的变化如图2所示。叶绿素a体现了藻类光合效率以及光能转化为化学能的关系，从实验中可以看到光自养与暗反应间叶绿素a含量变化很大（见图2（a）），随着时间的增长，光反应叶绿素a一直积累，以葡萄糖为底物的异养反应中最大值可达到0.69mg/L，是光反应的1.9倍，3种底物所积累的叶绿素含量接近；以葡萄糖为底物的暗反应最大值只有0.45mg/L，而暗反应条件下不加有机碳源，叶绿素a积累更少，只在第6天达到最大值0.17mg/L，而后逐渐减少，到第10天基本上不变化。

还原性糖类可以间接地反映藻类糖代谢的合成、转移等信息。由图2（b）分析可知，不投加有机碳源的光反应中糖类从第4天开始增加，到第12天达到最大值为0.35mg/L，之后不变化，到第12天开始减少，第14天质量浓度只有0.29mg/L，分析原因可能是开始消耗底物的还原糖类；而黑暗胁迫条件下还原糖类积累很少，最大值只有光反应的0.6倍。而对于不同的反应条件包括光自养、异养和光兼养以及黑暗对照发现，光兼养条件下消耗的底物质量浓度最大，而光自养比黑暗胁迫条件下所积累的还原糖多2.9倍。

Fig.2 Chemical position changes as the time图2 化学组成随时间的变化

由图2（c）分析可知，光反应第4天开始，蛋白质质量浓度显著增加，到第10天达到最大值0.71 mg/L，而最小值只有0.11mg/L，黑暗胁迫条件下蛋白质质量浓度变化不显著，第4天达到最大值0.20mg/L，之后逐渐较小。可以看出，暗反应中细胞的代谢和分裂都非常缓慢，因此物质积累很少。

2.3 不同有机碳源对脂肪酸组分及含量的影响

通过GC－MS分析脂肪酸组成及其含量（质量分数），结果如表2所示。

表2 脂肪酸含量与类型Table 2 The type and content of fatty acid%

续表2

三角褐指藻在不同的培养条件下脂肪酸含量变化显著，而且不饱和脂肪酸的类型有所不同，主要的脂肪酸为C16∶0，C16∶1，C20∶5，还有部分C18（C18∶1，C18∶2，C18∶3，C18∶4），其中兼养条件下的脂肪酸含量明显高于自养，总饱和脂肪和单不饱和脂肪酸含量在兼性条件下有所增加，多不饱和脂肪酸有所下降。

综上，通过考察光暗对比发现，暗反应条件对三角褐指藻的生长、生物量、细胞密度以及化学成分如蛋白质、还原糖、脂类积累等均有较大的影响，特别是在实验结束的前4天，光照条件下细胞密度随着时间增加变化显著，而黑暗条件下细胞密度仅为33%，而且蛋白质、糖类、叶绿素均出现减少，原因是暗反应条件下细胞分裂减慢，导致生物化学物质合成能力下降。在14天的实验过程中，黑暗条件下的三角褐指藻仍能够缓慢生长并在实验结束时保持相对稳定的活性，说明三角褐指藻有一定的耐受黑暗胁迫的能力，从而在恶劣环境中生存。通过实验发现，三角褐指藻可以适应不同的有机碳源，并且具有最适合的底物浓度，同时对黑暗胁迫具有一定的耐受力，这也导致了其在暗反应过程中有少部分叶绿素、糖类、蛋白质的代谢和合成。需要进一步研究不同的温度、氮含量等条件对于生化物质及脂类积累的影响，从而充分利用三角褐指藻获得相关的生物柴油及相关产品。

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（Ed.：YYL，Z）

Technology of Phaeodactylum Tricornutum to Extract Fatty Acid for the Biodiesel Production

HE Feng，FU Peng－cheng＊，XU Chun－ming
（Research Center of Renewable Energy，China University of Petroleum（Beijing），Beijing102249，P.R.China）

In order to understand the effect of light，carbon sources and concentration on thephaeodactylumtricornutum，the culture medium containing glucose，acetate and glycerol were chose，the biomass，cell concentration，biochemical substances and fatty acid content were tested.The results show that thephaeodactylumtricornutumis photoautotroph and mixotroph，which with selectivity for substrate concentration and organic carbon sources，the optimum concentration of glucose is 20 mmol/L，the optimal growth condition in 500mL flask contains that the temperature is（25±1）℃，the light intensity is 50 μmol/（m2·s），the pH is 7.5.Whatever the carbon sources are able to promote the biomass accumulation.When the cell concentration achieve to 2.5×106cells/mL in the evening of the culture，the protein，sugar，chlorophyll and TOL content were analyzed.The biomass accumulation and biomass change in different growth conditions were determined.By ultrasonic extraction and Soxhelt extraction，the total of lipid reaches 20%（dry weight）；The fatty acid content and composition with GC－MS were measured，and found the C16∶0and C16∶1are 34.8%and 11.9%（mass fraction）respectively，which are more than other components and could be used to extract bio－diesel.

Phaeodactylumtricornutum；Organic carbon source；Light/darkness；Glucose；Biomass；Total liquid；Biodiesel

TE39

A

10.3696/j.issn.1006－396X.2011.01.001

2010－10－27

何峰（1983－），男，黑龙江宾县，在读博士。

国家973科技计划项目资助（S2010021001）。

＊通讯联系人。

1006－396X（2011）01－0001－05

Received27October2010；revised11November2010；accepted20December2010

＊Corresponding author.Tel.：＋86－10－89731091；e－mail：hefeng20024406＠126.com