响应面分析法优化猪骨素提取工艺条件的研究

张 杰，潘风光，刘 婧，李洪山，安晓宁，刘静波，*

(1.吉林大学营养与功能食品实验室，吉林长春130062;2.吉林省白城水环境监测中心，吉林白城137000)

响应面分析法优化猪骨素提取工艺条件的研究

张 杰1，2，潘风光1，刘 婧1，李洪山1，安晓宁1，刘静波1，*

(1.吉林大学营养与功能食品实验室，吉林长春130062;2.吉林省白城水环境监测中心，吉林白城137000)

利用响应面法对猪骨素的提取工艺进行优化。在单因素实验基础上选取主要的实验因素与水平，根据中心组合(Box－Benhnken)实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，依据回归分析确定各工艺条件的影响因素，以提取液中的胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的综合指标为响应值作响应面回归。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出猪骨素提取的最佳工艺条件:提取压力为0.11MPa，时间为226min，液料比为3∶1。在此条件下，实际测得综合指标含量为0.5339%。

响应面分析，猪骨素，提取工艺条件

我国是畜禽养殖大国，骨资源极为丰富，每年产生的骨头有近200万t，且鲜骨中含有丰富的营养物质，被食品和营养学家们誉为“21世纪新型食品”［1］，其蛋白质和脂肪含量与肉类相似，此外，还含有大量的矿物质、维生素等［2］。骨素浸提了鲜骨中的可溶性营养物质，蛋白质(主要是胶原蛋白)含量能达到30%以上［3］，是对骨蛋白的充分利用，体系中还富含游离氨基酸、多肽、核酸等风味物质和钙、磷、磷脂、杂蛋白、粘多糖等营养成分，易于人体吸收，长期食用安全无毒性，是理想的味精替代品。在猪骨的综合利用过程中，骨素仅仅是一种中间体，是其它产品的原料。如可以对骨素进行酶解，生产动物水解蛋白(HAP)，也可以利用美拉德反应，生产具有特殊香气的肉类香精或者加入糖类、酱油、油脂等其它天然的原料，通过加热调理而制成具有肉香味、烧肉香味等风味的调味料［4］。长期以来，我国大多数的畜禽骨被废弃或用于加工附加值较低的工业原料和动物饲料(如骨粉)等，造成了极大的环境污染和资源浪费。因此，加大对畜禽骨深加工的开发力度，具有十分重要的意义。在发达国家，从20世纪70年代，日本开始采用现代提取技术加工骨汤，经低温真空浓缩得到鲜骨抽提物，实现了骨素的工业化生产。因为其来源天然，并且保持了鲜骨中天然的美味和香气，富有醇厚柔和的口感，很快成为日本人现代调味品的主流，并风靡日本、韩国等亚洲市场［5］。目前国内有多家企业生产骨素，规模较大的有漯河双汇集团、独凤轩等。提高骨素中营养物质(胶原蛋白)和风味物质(呈味游离氨基酸)的含量，优化提取工艺条件，是目前国内的骨素生产企业亟待解决的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪骨 吉林华正农牧业开发股份有限公司，破碎成2cm左右小块，蛋白质含量18.96%、脂肪含量10.60%、灰分含量54.09%、水分15.95%;硫酸铜、硫酸钾、氯化钠、浓硫酸、甲基红、溴甲酚绿、甲醛、盐酸、氢氧化钠、硼酸、考马斯亮蓝G250 均为国产分析纯。

ZD－2型自动电位滴定仪 上海雷磁公司;ZDX－35BI座式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;AG204电子分析天平(0.1mg～210g) 瑞士METTLER TOLEDO;QSY－16凯氏定氮仪 北京强盛分析仪器设备中心;CXC－06粗纤维测定仪、ZF－06B脂肪测定仪 上海瑞正仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 检测方法 脂肪的测定:索氏抽提法，GB/T 5009.6－1985;灰分(固形物)含量的测定:550℃灼烧法，GB/T5505－1985;蛋白质含量的测定:凯氏定氮法，GB/T5009.5－2003;胶原蛋白含量的测定:考马斯亮蓝G250法(Coomassive brilliant blue，G－250);游离氨基酸含量的测定:甲醛滴定法［6］。

1.2.2 猪骨素的提取 将鲜骨洗净，沸水中热烫2min，以去血去腥，按比例加入蒸馏水，入高压锅按不同的压力和时间提取。

1.2.3 综合指标的计算 采用将多指标转化为单一指标的方法对浸提效果进行优化预实验的研究表明，胶原蛋白和游离氨基酸含量的重要性呈一致性相关，并可用下式进行综合评价［7］:

综合指标=X1+X2

式中:X1为胶原蛋白含量(g/100g);X2为游离氨基酸含量(g/100g)。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 提取压力的影响 分别选择为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14MPa来进行实验，考察压力对胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的影响，实验条件:时间3h、液料比3∶1。

1.2.4.2 提取时间的影响 分别选择为1、2、3、4、5h来进行实验，考察时间对胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的影响，实验条件:压力0.12MPa、液料比3∶1。1.2.4.3 液料比的影响 分别选取液料比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1进行浸提，考察液料比对胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的影响，实验条件:压力0.12MPa，时间4h。

1.2.5 响应面分析 根据实验数据，选取骨汤中的胶原蛋白含量(%)和游离氨基酸含量(%)的综合指标为所考察的响应值。进行压力(X1，MPa)、时间(X2，h)和液料比(X3)3因素3水平的Box－Behnken实验设计。对压力、时间和液料比作如下变换:X1=(P－0.12)/0.02，X2=(t－240)/30，X3=(z－3)/0.5，以三次实验所得综合指标的平均值为响应值(Y)，采用design expert软件对实验结果进行响应面分析，建立数学模型，进行方差分析，并优化工艺参数。

表1 优化实验设计的因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 压力对胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的影响 由图1可知，随着压力的增加，骨汤中的胶原蛋白含量不断提高，这主要是由于增大浸提压力能有效软化骨质，促进骨中营养物质的溶出，但0.12MPa之后，蛋白质含量变化趋于平缓。而游离氨基酸含量呈先升后微降的趋势，0.12MPa时达到最大，可见压力过高，氨基酸的溶出量达到最大值后，继续增大压力不仅浪费能源还可能会在一定程度上破坏骨汤中的呈味氨基酸，导致氨基酸含量不升反降。综合以上分析，在优化实验中选取0.10、0.12、0.14MPa作为浸提压力的实验水平。

图1 浸提压力对胶原蛋白和游离氨基酸含量的影响

2.1.2 时间对胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的影响 由图2可知，随着提取时间的增加，骨汤中胶原蛋白含量和游离氨基酸含量不断升高，但4h之后，随着时间的增加，胶原蛋白和游离氨基酸含量趋于平缓，这主要是由于随着浸提时间的增加，骨中营养物质的溶出量也在增加，当浸提时间足够长时，营养物质已基本溶出。因此在优化实验中选取210、240、270min作为浸提时间的实验水平。

图2 浸提时间对胶原蛋白和游离氨基酸含量的影响

2.1.3 液料比对胶原蛋白含量和游离氨基酸含量的影响 由图3可知，随着液料比的增加，骨汤中胶原蛋白含量和游离氨基酸含量呈逐渐下降的趋势，加水量过多，骨汤中胶原蛋白和游离氨基酸含量降低，绝对量升高，但液料比过大会给浓缩过程带来负担;加水量过少则不利于原料中的营养物质和风味成分浸出，绝对浸出少。因此在优化实验中选取2∶1、3∶1、4∶1作为液料比的实验水平。

图3 液料比对胶原蛋白和游离氨基酸含量的影响

2.2 响应面分析以及提取工艺的优化

2.2.1 骨素提取工艺优化实验设计及结果 以胶原蛋白含量和游离氨基酸含量指标作为响应值，采用响应面回归(RSREG)进行数据分析［8］。骨素提取优化实验设计及实验结果见表2，分析结果见表3。

表3 综合指标回归方程的方差分析

表2 响应面实验结果

2.2.2 数学模型的建立及方差分析 以胶原蛋白和游离氨基酸含量的综合指标为响应值，经过回归拟合后的二次多项回归方程为:Y=0.53+0.026X1+7.250E －0.03X2－3.450E －0.03X3+1.825E －并对该模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，回归方程的失拟检验p=0.2335>0.1，差异不显著，总回归方程 F检验p＜0.0001，差异极显著，说明该模型与实际实验拟合较好，可以用于猪骨素生产中提取工艺蛋白质和游离氨基酸含量综合指标的理论预测，方程一次项的影响中X1、X2和X3的p＜0.01(差异极显著);二次项的影响中的p值＜0.01，差异极显著的p=0.0539，差异较显著，X1X2的交互作用p=0.2840>0.1，差异不显著，X1X3、X2X3的交互作用p＜0.01，差异极显著。由于模型的p＜0.01，因此该方程的回归模型差异极显著。从回归系数的大小可以看出，压力对骨汤中蛋白质和氨基酸含量的综合指标影响最大，其次是时间，液料比的影响最小。相关系数R2=0.9381，说明响应值的变化有93.81%来源于所选变量。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

2.2.3 响应面直观分析 响应曲面分析(RSM)的图形是特定的响应值Y对应自变量构成的一个三维空间图，可以直观地反映出各自变量对响应变量的影响［9－10］。

以综合指标为响应指标值，对压力、时间和液料比3个因素进行响应面分析，其响应面图结果见图4～图6。

图4 Z=f(X1，X2)的响应面图

图5 Z=f(X1，X3)的响应面图

由图4～图6可以看出，压力、时间和液料比3个因素对综合指标的影响程度在切面上都呈抛物线趋势，二者之间有明显的交互作用，由响应面图以及相应图谱分析可知，压力对骨汤中蛋白质和游离氨基酸含量综合指标的影响最大，其次是时间，液料比的影响最小。

2.2.4 最佳条件的优化与验证 对回归方程取一阶偏导数等于零，整理可得如下三式:

图6 Z=f(X2，X3)的响应面图

式(1)～式(3)联立方程组，解得X1=－0.4226，X2=－0.4617，X3=0，代入前述的变换公式得到提取压力为0.11MPa，时间为226min，液料比为3∶1，在此条件下，实际测得综合指标含量为0.5339%，回归模型预测含量理论值可达0.5346%，实际测定值与理论预测值无显著差异。

3 结论

通过单因素实验，以及在此基础上采用三因素三水平响应面法实验，建立了响应值与各因素之间的数学模型，依此模型可以预测理论提取率。根据此二次回归模型，确定猪骨素提取工艺的最佳参数:提取压力为0.11MPa，时间为226min，液料比为3∶1，实际测得综合指标含量为0.5339%，在此条件得到高蛋白质和游离氨基酸含量的骨素，可用于水解动物蛋白的生产及进一步加工成调味料和肉味香精，回归模型预测含量理论值可达0.5346%，与实际测定值无显著差异，建立的数学模型能很好地预测各因素同综合指标含量之间的关系，对优化猪骨素提取工艺、提高企业生产效率有一定的指导意义。

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Optimization of extraction technology conditions of swine bone extract using response surface methodology(RSM)

ZHANG Jie1，2，PAN Feng－guang1，LIU Jing1，LI Hong－shan1，AN Xiao－ning1，LIU Jing－Bo1，*
(1.Laboratory of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，China;2.China Water Environmental Monitoring Center of Baicheng City，Baicheng 137000，China)

Based on single factor tests，the optimum extraction conditions of swine bone extraction were obtained through Box－Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum extraction conditions of comprehensive index on contents of collagen protein and ammonia nitrogen in bone soup were as follows:extraction pressure 0.11MPa，extraction time 226min，ratio of water to bone 3∶1.Under this condition，the comprehensive index on contents of collagen protein and ammonia nitrogen was 0.5339%.

response surface methodology;pig swine bone;extraction technology conditions

TS201.1

B

1002－0306(2011)06－0286－04

2010－05－04 *通讯联系人

张杰(1982－)，女，硕士生，助理工程师，研究方向:营养与功能食品。

长春市科技支撑计划畜禽产品专项(08KZ26)。