牛蒡多酚氧化酶的特性及酶促襊变的抑制

李 超，郑 义，王乃馨，庄 平

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏徐州221008;2.徐州市金地杰农业发展有限公司，江苏徐州221116)

牛蒡多酚氧化酶的特性及酶促襊变的抑制

李 超1，郑 义1，王乃馨1，庄 平2

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏徐州221008;2.徐州市金地杰农业发展有限公司，江苏徐州221116)

采用制作丙酮粉的方法提取了牛蒡中的多酚氧化酶(PPO)，并对其酶学特性进行了研究。实验结果表明，牛蒡多酚氧化酶最适温度为40℃，最适pH为6.0，在40℃下热稳定性较好，而在70℃加热3min即可使其完全失活。牛蒡PPO的米氏常数为0.1337mol/L，最大反应速率Vmax为7.387U/min。通过响应面实验设计的方法对防止牛蒡酶促褐变的配方进行了优化，结果表明当复合护色液中EDTA、L－半胱氨酸和柠檬酸亚锡二钠的护色剂的浓度都为0.04%(w/v)时，牛蒡的褐变度最小。

牛蒡，多酚氧化酶，酶促褐变

牛蒡(Arctium Lappa L.)原产于北欧、西伯利亚和中国北部，属于菊科牛蒡属两年生草本植物，其肥大肉质的根可供药食两用。牛蒡根含有丰富的菊糖及挥发油、牛蒡酸、多酚、纤维素等，具有清除体内垃圾，改善体循环，尤其对糖尿病、性机能减退、肥胖症、风湿、类风湿、解肝毒、便秘、内外痔等病症有明显效果［1］。目前，我国已经成为世界上最大的牛蒡生产大国，其产品主要用于保鲜出口，其它产品有牛蒡罐头、牛蒡酱、牛蒡茶、牛蒡丝以及菊糖等。多酚氧化酶(PPO，E.C.1.14.18.1)是一种含有铜离子的酶，广泛存在于植物、动物和一些微生物中。在果蔬加工过程中，多酚类物质在PPO和氧气的作用下，邻位的酚氧化为醌，醌很快聚合成为褐色素而引起组织褐变。酶促褐变不仅有损于果蔬感官品质，而且导致其营养价值下降，特别是在热带鲜果中，酶促褐变导致的直接经济损失达50%。采用抗坏血酸、L－半胱氨酸等护色剂处理可以减少莲藕［2］、茭白［3］、苹果［4］等果蔬的酶促褐变。抗坏血酸钙［5］、4－己基间苯二酚［6］等对牛蒡的酶促褐变有较好的抑制作用，但是对牛蒡PPO的酶学特性研究较少。许多研究采用感官评定的方法对褐变度进行测定，可能造成人为的误差。本文对牛蒡中的PPO部分酶学性质进行研究，并采用色差计测定牛蒡的色反应褐变程度，通过响应面设计实验的方法对防止酶促褐变的护色剂的配方进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛蒡 购自徐州当地农贸市场，贮存于－18℃备用;其它化学试剂 均为分析纯。

TU－1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;TGL－20M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机有限公司;PHS－3CA型精密酸度计 上海世义精密仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛蒡PPO粗酶液的提取 将冷冻牛蒡清洗后去皮，切成小块，称取 50g与 100mL冷冻丙酮(－18℃)在组织捣碎机中匀浆1min，然后迅速抽滤得到丙酮粉。用冷风将丙酮粉吹干至无丙酮味，称取1g分散于50mL在4℃预冷过的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，搅拌30min后用纱布过滤，滤液在4℃离心30min，离心力18000×g，上清液即为粗酶液。

1.2.2 PPO活力的测定 在比色皿中加入2mL缓冲液、0.5mL 0.01mol/L儿茶酚溶液以及0.5mL粗酶液，在420nm下2min内每隔5s测吸光值随时间的变化。以每分钟增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位(0.001ΔOD420/min/mL)。

多酚氧化酶酶活的计算公式:E=M×60/V

其中:M－每秒钟增加的吸光值;V－粗酶液的体积，mL。

1.2.3 PPO最适pH的测定 配制不同pH的Britton－Robison缓冲溶液，在比色皿中分别加入2mL不同pH的缓冲溶液，0.01mol/L的邻苯二酚溶液0.5mL，然后加入0.5mL粗酶液，迅速测定溶液的吸光值，以最高酶活力为100%，求得其它pH下的相对酶活。

1.2.4 PPO最适温度的测定 不同温度下PPO的活力在最适pH下测定。取2mL的缓冲溶液、0.5mL 0.01mol/L的邻苯二酚溶液，在20～80℃范围内，每隔10℃保温 5min，加入 0.1mL粗酶液，然后迅速在420nm处测定各PPO的活力。

1.2.5 PPO的热稳定性 酶的热稳定性在40、50、60、70℃时测定。取10mL酶液在相应温度下加热一定时间后，在冰浴中迅速冷却，在室温下测定残余酶活。

1.2.6 底物浓度与 PPO活力的关系 以浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08mol/L的邻苯二酚作为底物，在室温下测定PPO的活性。根据Lineweaver－Burk作图法得米氏常数Km和最大反应速率Vmax值。

1.2.7 护色剂对PPO活性的影响 分别用最适pH的缓冲溶液配制浓度为2mmol/L和10mmol/L的柠檬酸、异维生素C钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、L－半胱氨酸和柠檬酸亚锡二钠溶液，测定各种护色剂对PPO活力的抑制率。

1.2.8 护色剂配方优化 根据酶学特性的研究结果，选择显示较高抑制率的护色剂作为防止牛蒡酶促褐变的护色剂。将牛蒡切成2mm的薄片浸泡于护色液中30min后，捞出沥干水分，置于室温下12h后测定其褐变度。采用Box－Behnken实验设计，对护色剂的浓度进行优化。

1.2.9 褐变度测定 采用全自动测色色差仪通过反射法测定牛蒡片的色泽。仪器的标准白板L* =93.53，a*=－0.82，b* =0.10。用L*值表示牛蒡的褐变度，L*值越大，表明牛蒡的褐变度越小。

2 结果与分析

2.1 pH对PPO活力的影响

图1反映采用邻苯二酚为底物时pH对牛蒡PPO活力的影响。由图1可知，牛蒡中PPO最适pH为6.0。众多的研究表明，多数水果中的PPO在接近中性pH时显示最大的活力。由图1还可以看出，在极端酸性和碱性时酶活力急剧降低，当pH＜6.0或pH>6.0时，PPO相对活性显著下降，pH小于3.0或者大于9.0时，PPO几乎完全失活。在pH低于3.0的酸性环境中，酶中的铜离子被解离出来，与酶蛋白脱离，使酶失活。在强碱条件下，铜会解离成氢氧化铜，从而使酶活性显著降低［2］。但是根据Lee等［7］的研究，在极端碱性环境下PPO的失活也可能是由于酶蛋白的构象改变、或者迅速与美拉德反应、Strecker降解的产物发生反应。因此，在果蔬加工中，通过调节pH可有效抑制PPO活力。

图1 pH对牛蒡PPO的影响

2.2 温度对PPO活力的影响

温度对牛蒡PPO活力的影响如图2所示。由图可见，PPO活性先随温度升高而上升，在40℃时达到最大值，而后又随温度的升高而下降，在低于20℃、高于50℃时，PPO相对活力比较小，这是因为随着温度升高，酶反应速度加快，当温度高于50℃时，酶蛋白发生变性失活。因此在牛蒡加工中可采用低温处理来抑制其PPO活性，延缓褐变。

图2 温度对牛蒡PPO活力的影响

2.3 PPO的热稳定性

将牛蒡PPO在不同温度下(40～70℃)保温后，立即冰浴冷却测定其残余活力，结果如图3所示。由图3可见，PPO在40℃较为稳定，但是当温度高于50℃时酶活随着保温时间的增加，残余酶活力迅速下降，90℃保温5min后，残余活力只有原始的10%，10min后完全失活。因此在牛蒡加工中，可采用热烫的方法来钝化PPO，抑制褐变。但是如果采用热处理的方法不当，会使其品质受到一定的影响。

图3 牛蒡PPO的热稳定性

2.4 牛蒡PPO的动力学特性

图4是邻苯二酚底物浓度对牛蒡PPO反应速度

图4 底物浓度对牛蒡PPO活力的影响

图5 牛蒡PPO的Lineweaer－Burk图

2.5 护色剂对PPO活力的影响

不同护色剂对牛蒡多酚氧化酶的抑制效果如表1所示。由表1可见，L－半胱氨酸对牛蒡PPO的抑制作用最强，EDTA和柠檬酸亚锡二钠次之，而异维生素C钠的抑制作用较小。抑制酶促褐变的物质很多，但是对不同来源的PPO，抑制作用并不相同。

表1 护色剂对牛蒡PPO酶活的影响

2.6 护色剂配方优化

2.6.1 不同护色剂浓度对牛蒡酶促褐变的影响 根据PPO酶学特性中护色剂对酶活的抑制作用，选择L－半胱氨酸、EDTA和柠檬酸亚锡二钠作为防止酶促褐变的护色剂。不同护色剂浓度对牛蒡褐变的影响如图6所示。由图6可见，随着护色剂浓度的增加，牛蒡的褐变度减小。0.03%(w/v)的L－半胱氨酸对牛蒡的护色效果较好，浓度进一步增加，对褐变不再有显著性影响。而EDTA和柠檬酸亚锡二钠浓度都为0.05%(w/v)时，牛蒡的褐变度最小。

图6 护色剂浓度对牛蒡褐变的影响

2.6.2 护色剂配方的优化 由单因素实验的结果，选取EDTA、L－半胱氨酸和柠檬酸亚锡二钠等三种护色剂复配，采用Box－Behnken正交回归实验设计对护色剂的浓度进行优化。以L*值为指标，EDTA浓度的水平选择0.04%、0.05%和0.06%，L－半胱氨酸浓度水平选择0.02%、0.03%和0.04%，柠檬酸亚锡二钠浓度的水平选择0.04%、0.05%和0.06%。实验设计与结果见表2。

表2 Box－Behnken实验设计和结果

对表2中的实验结果进行方差分析，结果见表3。由方差分析可知，回归模型高度显著(p=0.0098＜0.01)。由于模型的失拟项不显著(p=0.8526>0.05)，Adeq Precision等于10.799，远大于4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对牛蒡的褐变度进行预测。

由回归模型系数显著性检验结果可知，三种护色剂对牛蒡褐变都有显著性影响，L－半胱氨酸与EDTA、L－半胱氨酸与柠檬酸亚锡二钠之间有协同增效的护色效果。

表3 二次正交回归方程模型方差分析

2.6.3 响应面分析与优化 根据回归方程所作的响应面图直观反映了各个因素对牛蒡褐变度的影响(图7)。由图7可见，柠檬酸亚锡二钠对牛蒡褐变度L*值的影响是线性的，而L－半胱氨酸和EDTA对褐变的影响是非线性的，与表3中的方差分析结果一致。为进一步确定最佳点，在模型范围内选择出发点，按照模型使用快速上升法进行优化，当EDTA、L－半胱氨酸和柠檬酸亚锡二钠的浓度都为0.04%(w/v)时，牛蒡的褐变度最小。

图7 EDTA、柠檬酸、L－半胱氨酸及其相互作用对牛蒡L*值的影响

3 结论

由于PPO的作用，牛蒡在加工过程中容易发生酶促褐变。实验结果表明，牛蒡 PPO酶反应遵循Michaelis－Menten动力学，最适温度为40℃，最适pH为6.0。因此要尽量避免在此温度和pH下进行牛蒡加工。柠檬酸亚锡二钠、EDTA和L－半胱氨酸对牛蒡的酶促褐变有较好的抑制作用，将牛蒡切片浸泡于由0.04%(w/v)的柠檬酸亚锡二钠、EDTA和L－半胱氨酸组成的复合护色剂中30min，可以在12h内防止其发生褐变。作为一种新的酶促褐变的护色剂，柠檬酸亚锡二钠可以有效地防止牛蒡的酶促褐变，可以作为除抗坏血酸、EDTA等传统抗褐变剂之外的新型添加剂。

［1］李丹丹.牛蒡菊糖的制备、结构与特性［D］.无锡:江南大学博士毕业论文，2007.

［2］王向阳，姜丽佳，王忠英.莲藕的酶促褐变及其贮藏中褐变的控制［J］.农业工程学报，2009，25(4):276－280.

［3］马文锦，刘树兴，凌建刚，等.茭白中多酚氧化酶活性的测定及护色效果研究［J］.食品与发酵工业，2008，34(12):187－190.

［4］Eissa H A，Fadel H H M，Ibrahim G E，et al.Thiol containing compounds as controlling agents of enzymatic browning in some apple products［J］.Food Res Int，2006，39(8):855－863.

［5］诸永志，王静，王道营，等.抗坏血酸钙对鲜切牛蒡褐变及贮藏品质的影响［J］.江苏农业学报，2009，25(3):655－659.

［6］诸永志，王静，王道营，等.4－己基间苯二酚对鲜切牛蒡褐变及贮藏品质的影响［J］.西南农业学报，2009，22(4):1061－1064.

［7］Lee C Y，Kagan V，Jaworski A W，et al.Enzymatic browning in relation to phenolic compounds and polyphenol oxidase activity among various peach cultivars［J］.J Agri Food Chem，1990，38(1):99－107.

Characterization of polyphenoloxidase
and inhibition of enzymatic browning in burdock

LI Chao1，ZHENG Yi1，WANG Nai－xin1，ZHUANG Ping2
(1.College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China;2.Xuzhou Excellent Land Agriculture Development Co.，Ltd.，Xuzhou 221116，China)

An acetone powder was prepared from burdock for extracting polyphenoloxidase(PPO)，and the characterization of PPO was studied.The results indicated that burdock PPO had a optimum pH of 6.0，showing maximum activity at 40℃.Heated for 3min，PPO of burdock would been inactivated completely，though it showed very stable at 40℃.The Km of burdock PPO was 0.1337mol/L，while its Vmax was 7.387U/min.Response surface methodology was adopted to optimize the combination of antibrowning agents.When the concentration of EDTA，L－cystine and distannous citrate in antibrowning solution was 0.04%，the browning degree of burdock was the lest.

burdock;polyphenoloxidase;enzymatic browning

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0121－04

2010－04－19

李超(1978－)，男，讲师，博士，研究方向:天然产物化学。

苏北科技发展计划(SBN200910087);徐州工程学院青年项目(XKY2010208)。