甘薯提取物体外促进 PC12和 SK-N-SH细胞增殖及突起生长作用研究

孙丽华,郑晓亮,颜冬梅,屠凌岚,李昉赟,王 茵

浙江省医学科学院,杭州 310013

甘薯提取物体外促进 PC12和 SK-N-SH细胞增殖及突起生长作用研究

孙丽华,郑晓亮,颜冬梅,屠凌岚,李昉赟,王 茵＊

浙江省医学科学院,杭州 310013

观察甘薯提取物促进体外培养的 PC12和 SK-N-SH细胞的增值和突起生长作用。采用体外培养 PC12和 SK-N-SH细胞,以MTT法检测 PC12和 SK-N-SH细胞的活性率,以细胞突起长度超过 2倍胞体或突起数目 3个以上者为阳性细胞计算阳性细胞率来评价甘薯提取物对体外培养 PC12和 SK-N-SH细胞的增值和突起生长的促进作用。实验发现甘薯提取物能够促进 PC12和 SK-N-SH细胞的突起数目增加,长度增长,阳性细胞数增多,具有一定的神经营养作用,是一种很好的神经保护剂。

甘薯提取物;PC12细胞;SK-N-SH细胞;增殖;突起生长

Abstract:An investigation wasmade on observe the effectof s weetpotato extracton promoting PC12 and SK-N-SH cells proliferation and neurite outgrowth.Using PC12 and SK-N-SH cells cultured in vitro,as detecting the living ratesof PC12 and SK-N-SH cells byMTT and calculating positive cell rate ofwhich length of neurite exceeding 2 times of the neural body or the number of neurite exceeding 3,to evaluate the promoting effect of sweet potato on PC12 and SK-N-SH cells proliferation and neurite outgrowth.The results showed that sweet potato extract is able to promote PC12 and SK-N-SH cells neurite outgrowth and to increase the numberofpositive cells,has a certain neurotrophic effect and it is a good neuroprotective agent.

Key words:s weet potato extract;PC12 cells;SK-N-SH cells;proliferation;neurite outgrowth

随着社会发展,神经系统退行性疾病的发病率急剧上升,对神经系统作用的食品及药物研究已成为一项热点,因此寻找具有神经营养活性的物质,是一件有意义的工作。神经元损伤和凋亡是老年痴呆、帕金森和脑血管病等神经系统疾病的共同病理机制。临床上除了采用对症治疗外,神经营养和神经保护剂的应用对疾病的控制和症状改善也起到了良好的作用。本研究探讨了甘薯提取物对体外培养神经细胞的神经营养作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

胎牛血清,购自杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培养基和胰蛋白酶 (Trypsin),购自Gibco公司;噻唑蓝 (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)和二甲基亚砜(DMSO),均购自 Sigma公司;异丙醇,购自汇普化工仪器有限公司;Recombinant Humanβ-NGF,购自PeproTech公司。

1.1.2 仪器设备

Shellab Model 2300型 CO2培养箱 (Sheldon Manufacturing公司产品);DG3022A型酶联免疫检测仪 (华东电子管厂生产);BH-2生物显微镜 (日本Olympus公司产品);MOTI C生物显微图像采集分析系统 (厦门麦克奥迪实业集团有限公司产品)。

1.1.3 甘薯提取物

于 4℃避光保存备用,给药前以DMSO溶解,再以无血清DMEM稀释至所需浓度 (DMSO终浓度不高于 0.1%)。

1.1.4 细胞株

人神经母细胞瘤 (SK-N-SH)细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 (PC12)细胞,购自中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 甘薯提取物的制备

取西蒙甘薯冻干粉加无水乙醇,于恒温水浴震荡器中震荡提取,经真空抽滤或离心,上清液于旋转蒸发真空浓缩,完全除去乙醇后用氢氧化钠的甲醇溶液溶解后,水解,水解液用氯仿充分混合振荡提取,取下层溶液真空浓缩蒸干完全除去溶剂,后经硅胶柱层析得甘薯提取物。

1.2.2 细胞株培养

用含 10%胎牛血清、40 U/ml庆大霉素的DMEM培养液,于 37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中传代培养,取对数生长期细胞用于实验。

1.2.3 体外细胞活率检测试验 (MTT法)

取对数生长期 SK-N-SH细胞和 PC12细胞分别调整细胞悬液浓度为 5×104个 /mL和 2×104个 /mL,每孔 100μL细胞悬液接种于 96孔细胞培养板中,接种 24 h后给予不同浓度受试物 (100μL/孔),分别设空白对照组以及 5个浓度 (0.08,0.4,2,10,50μg/mL)受试物组。SK-N-SH细胞和 PC12细胞分别继续培养 144 h(6 d)和 96 h(4 d)后,每孔加入 100μL MTT(1 mg/mL,以 DMEM培养液溶解),37℃孵育 4 h,弃去各孔内液体后加入 150μL酸化异丙醇 (含 0.04 mol/L HCl),避光放置 30 min,DG3022A型酶联免疫检测仪测定 570 nm处吸光度,计算细胞活率。

1.2.4 体外细胞突起生长检测[1]

取对数生长期 SK-N-SH细胞和 PC12细胞分别调整细胞悬液浓度为 5×104个 /mL和 2×104个 /mL,每孔 3 mL细胞悬液接种于 96孔细胞培养板中,接种 24 h后给予三个浓度 (0.1,1,10μg/mL)受试物,光学显微镜下观察给药后 24,48,72,96 h细胞突起生长情况,每组随机选取 10个视野拍照,以突起长度超过胞体 2倍或突起数量 3个以上者为阳性细胞,计数阳性细胞率,以受试物处理组细胞阳性率与对照组细胞阳性率的比值评价受试物促进细胞突起生长活性。

1.2.5 数据统计方法

实验进行三次重复,结果以±s表示。用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 甘薯提取物对神经细胞活率的影响

图1、图 2是 MTT法显示的 PC12细胞和 SK-NSH细胞的增殖生长情况,结果表明 PC12细胞在不同浓度作用情况下其细胞活力都明显高于空白对照组,细胞生长明显增快,倍增时间明显缩短,细胞密度不断增加,在中等浓度 2μg/mL时细胞活力最强,其细胞活率提高 34.7%和 24.7%。而 SK-NSH细胞在高浓度 50μg/mL时表现出了生长萎缩的现象,这可能是高浓度时细胞生长过快,其所需的营养耗竭,导致细胞生长活力减小。而在其他浓度作用时与空白对照组相比仍表现出了细胞生长活力的明显增强,并随受试物浓度的增加而增强,呈现出了剂量依赖性生长。

2.2 甘薯提取物对神经细胞突起生长的影响

甘薯提取物对神经细胞突起生长的影响情况如图 3、图 4所示,实验证实受试物样品给予 24 h后观察,无论在低剂量、中剂量还是高剂量浓度情况下PC12细胞和 SK-N-SH细胞其阳性细胞率的比值均明显高于空白对照组,PC12细胞的阳性率最高可达到空白对照组的 6.2倍左右,SK-N-SH细胞的阳性率最高可达到空白对照组的 1.7倍左右,说明受试物样品能够明显促进 PC12细胞和 SK-N-SH细胞神经突起的分化和伸长生长,具有一定的神经营养作用。

在显微镜下对细胞形态观察的实验结果如图 5～8所示,未经处理的 PC12细胞呈圆形、短梭形或三角形,有的细胞两极有短突起。添加不同浓度的甘薯提取物组的 PC12细胞在培养 48 h后即有明显突起伸出,有的较长且增粗,长短不一突起个数也明显增多。而未处理的 SK-N-SH细胞呈梭形或多角形有的有较短突起,而受试物样品组 SK-N-SH细胞在 72h明显分化出了神经突起并有了明显的伸长生长。这说明受试物在 0.1μg/mL浓度下,对 PC12细胞及 SK-N-SH细胞的生长及突起伸长就有一定的促分化作用,进一步说明受试物具有一定的神经营养活性。

3 讨论

离体培养神经细胞是研究神经元损伤和药物作用的体外理想模型 。体外培养的大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)和人类神经母瘤细胞 (SK-N-SH细胞)虽然不是真正的神经元,但其在体外培养状态下的生长特性类似神经元,具有较典型的神经内分泌细胞特征,故广泛用于研究神经细胞分化、离子通道、受体、递质分泌的实验材料,也是研究神经毒性的最主要的细胞株[2-3]。

甘薯是旋花科甘薯属的一个重要栽培品种,又名红薯、白薯、地瓜、番薯、山芋、红苕等。世界上有111个国家栽培甘薯。在现代生活中,甘薯早已超出传统意义上粮食的概念。随着人们对甘薯研究的深入,甘薯中的一些有效成分正在逐渐被人们所揭示[4],然而有关甘薯对神经系统的营养作用尚未见报道,是一个非常值得探索的领域。

本实验研究结果显示西蒙甘薯提取物能够促进PC12细胞和 SK-N-SH细胞的增值和细胞突起生长、伸长,对神经细胞具有一定的营养作用,但其具体有效成分尚待进一步研究。本实验为甘薯类功能食品干预神经退行性疾病的研究奠定了基础,同时随着老龄化社会的到来,神经系统的营养物质的需求也将不断上升,具有广阔的开发前景和研究意义。

1 AkiraM,Jiro F,Masaharu K,et al.ALK receptor tyrosine kinase promotes cell growth and neurite outgrowth.J Cell Sci,2004,117:3319-3329.

2 Cui X(崔旭 ),Yuan H(袁红 ),WangQ(王青 ),et al.Efect of Yi Zhi San on cell proliferation and apoptosis in cultured PC12 cell.Chin J Geriatr Heart B rain Vessel D is(中华老年心脑血管病杂志),2006,8(3):198-201.

3 Chu YQ(楮燕琦 ),LiW(李玮 ),Zhang L(张兰 ),et al.Efects of protein phosphatase inhibitorOkadaic acid on phosphorylation of Tau protein in human neuroblastoma SK-N-SH cells.Chin J Cell B io(细胞生物学杂志),2006,28:742—746.

4 Zhao XL(赵秀玲).Nutrition componentsof sweetpotato and its functions.Food Nutr Chin(中国食物与营养),2008,10:58-60.

Effects of Sweet Potato Extract on Promoting PC12 and SK-NSH Cells Proliferation and Neurite Outgrowthin V itro

SUN Li-hua,ZHENG Xiao-liang,YAN Dong-mei,TU Ling-lan,L I Fang-yun,WANG Yin＊
Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013

R965.1

A

1001-6880(2011)01-0149-04

2010-04-16 接受日期:2010-07-22

浙江省科技厅重大专项项目(2007C12074)

＊通讯作者 Tel:86-571-88215510;E-mail:wy3333@163.com