羊栖菜岩藻黄质的提取工艺研究

尹尚军，徐 涛，刘丽平，汪财生，钱国英

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100)

羊栖菜岩藻黄质的提取工艺研究

尹尚军，徐 涛，刘丽平，汪财生*，钱国英

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100)

以真空冷冻干燥羊栖菜为原料，HPLC法检测岩藻黄质提取率为指标，研究了羊栖菜中岩藻黄质提取的最佳溶剂及工艺优化参数。结果表明，羊栖菜中岩藻黄质提取的最佳溶剂配比为90%乙醇和丙酮体积比3∶1，液料比40∶1，65℃水浴振荡提取两次，每次各80min，得岩藻黄质提取率为1.067mg/g(干重)，粗产品得率为1.02%，纯度约为13.02%。实验结果为岩藻黄质色素产品开发提供了新的材料来源与工艺参考。

羊栖菜，岩藻黄质，提取工艺

羊栖菜(Sargassum fusiforme)属于褐藻门马尾藻科，在我国主要分布于广东、福建、浙江等地海域［1］。既能食用又能药用，具有较高的营养和药用价值。羊栖菜及其提取物中有多种抗肿瘤和改善人体免疫的活性成分，对高血压、大肠癌等均有一定疗效［2］。目前，国内外对羊栖菜中多糖、氨基酸和蛋白质、软脂酸等研究报道较多［3－5］，而其中重要活性物质色素类化合物如岩藻黄质研究较少。岩藻黄质(fucoxanthin，分子式C42H58O6)属于类胡萝卜素的一种(见图1)，广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中［6］，呈黄褐色，从甲醇中得红棕色晶体，色价高、抗氧化性强，作为一种功能性天然色素已引起人们广泛关注。国内外学者研究发现，岩藻黄质具有抗衰老、减肥、抗癌、神经细胞保护，增加小鼠体内的DHA(二十二碳六烯酸)和ARA(花生四烯酸)的含量等功能［7－8］。因此，岩藻黄质作为药物、保健品以及护肤美容产品的开发趋势在市场上显而易见。近几年从海带干粉中提取工艺研究有少量报道，但由于其抗氧化作用强，一般加工干燥的海藻体中岩藻黄质极容易遭受破坏，提取率方面一直未达到理想的效果。因此，本文选用冰冻保存的羊栖菜海藻为原料，通过影响羊栖菜岩藻黄质提取工艺过程中温度、时间、液料比等主要因素优化，旨在开发丰富的海洋资源，提高藻类羊栖菜附加值，并为其新型生产途径及工业化生产提供一定理论依据。

图1 Fucoxanthin结构式［9］

1 材料与方法

1.1 材料与设备

羊栖菜 购于浙江省温州洞头县5～6月新鲜藻体，清水冲洗表面泥沙、盐粒，沥干后于－20℃冰箱中保存，实验前取冰冻藻体于真空冷冻干燥，万能粉碎机粉碎，过60目筛，于－20℃冰箱中避光密封保存备用;岩藻黄质标准品 Sigma公司，020M1541;甲醇、乙腈 色谱纯;其余实验所需试剂 均为分析纯。

Thermo离心浓缩冷冻干燥系统 ModulyDD－230 VLP200;UV－3000型紫外可见分光光度计 上海美谱达;Agilent－1100型高效液相色谱仪 美国Agilent;DK－8D型超级恒温水浴锅 上海齐欣;RE52－4型旋转蒸发仪 上海沪西;FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羊栖菜岩藻黄质的提取工艺 称取预处理羊栖菜粉末，置于具塞三角瓶中，按比例加入提取溶剂，并外包裹锡箔纸后，120r/min恒温水浴振荡加热提取1h，5000r/min离心10min，收集滤液，在旋转蒸发器中真空浓缩至红褐色粘稠状，冷冻干燥成粉末粗品保存。

1.2.2 岩藻黄质最大吸收峰的确定及提取溶剂筛选羊栖菜按上述工艺用乙醇溶剂提取上清液稀释至一定浓度后，与岩藻黄质标准品乙醇溶液分别于紫外可见分光光度计中350～700nm波长下扫描，确定岩藻黄质最大吸收波长。平均称取等量羊栖菜粉末5份，参考文献［10］方法改进，分别选用不同极性的5种溶剂在相同条件下浸提，将上清液样品处理后直接用高效液相色谱仪测定岩藻黄质含量，比较提取效果。

1.2.3 提取最佳工艺参数优化 实验以岩藻黄质提取率为响应值，选取影响羊栖菜岩藻黄质提取的溶剂比、提取温度、时间、液料比进行单因素实验，并综合考虑各因素影响后，选取三因素三水平进行 L9(33)正交实验(见表1)，确定最佳提取工艺。

表1 正交实验设计因素水平表

1.2.4 岩藻黄质含量、提取率分析 岩藻黄质含量检测参考文献［11］方法改进，色谱条件:Hypersil ODS C－18分析色谱柱(Thermo，4.6mm×250mm×5μm)，UWD450nm，柱温30℃，乙腈/甲醇/0.1%醋酸铵溶液(V/V/V，75∶15∶10)，流速1mL/min。将岩藻黄质标准品用无水乙醇配制成1、4、8、16、32μg/mL系列浓度，Agilent 1100高效液相色谱仪检测分析，外标法定量。

羊栖菜经溶剂提取的上清液定容，过0.45μm滤膜后上机分析，求出样品羊栖菜中岩藻黄质含量，并进一步计算羊栖菜中岩藻黄质提取率(mg/g)。

岩藻黄质提取率(mg/g)=m/M

其中:m－样品溶液中岩藻黄质质量(mg);M－样品液中羊栖菜藻体质量(g)。

2 结果与分析

2.1 岩藻黄质提取液的紫外扫描结果

按1.2.1方法提取，取上清液于紫外分光光度计中扫描，同时与岩藻黄质标品比较，结果如图2所示。扫描曲线发现，羊栖菜乙醇浸提液及标品岩藻黄质在可见光波长450nm左右处均有较强吸收峰，两样品与肖策报道的海带中提取的岩藻黄质扫描图谱中特征吸收峰基本一致［10］，峰型较宽，表明羊栖菜乙醇粗提取物中主要含有岩藻黄质类色素，并在580、630、680nm附近也见较弱的吸收峰，可能含有叶绿素等较多的其它色素［6］。因此，后续岩藻黄质实验定量选择波长450nm，而且粗提液中岩藻黄质有待进一步分离纯化研究。

图2 岩藻黄质提取液紫外－可见扫描图谱

2.2 高效液相分析岩藻黄质含量结果

根据1.2.4色谱条件下岩藻黄质标品系列浓度与样品上机分析得色谱图，如图3所示，样品与标品中岩藻黄质色谱峰均在5.825min有较高的分辨率;以岩藻黄质色谱峰面积为纵坐标，标样浓度为横坐标，绘制线性回归曲线得Y=85.17344X－1.67910，R=0.99981，RSD=±4.52%(n=4)，加标回收率94.08%(n=4)，表明在此浓度范围内线性较好，岩藻黄质色谱峰得到有效分离，样品检测结果有效。

图3 岩藻黄质标品与样品提取液检测色谱图注:1:4μg/mL岩藻黄质标准品;2:样品。

2.3 提取溶剂的筛选

岩藻黄质在中性条件下难溶于水、甲醇等极性较高的溶剂，易溶于酯类和非极性有机溶剂，为脂溶性色素［10］，因此为了能将羊栖菜中岩藻黄质充分提取出来，实验称取5份预处理过的羊栖菜各10g，分别选择用90%乙醇［12］、丙酮、二甲基亚砜、石油醚、二氯甲烷五种不同极性的溶剂，在相同条件下按上述方法分别浸提，滤液经过定容，过0.45μm滤膜后检测，比较岩藻黄质提取率。结果如图4所示，提取效果最佳的溶剂为乙醇，提取率达0.915mg/g，其次是丙酮，提取率为0.866mg/g，石油醚效果最差;溶剂筛选结果与肖策从海带干粉中提取效果顺序无水乙醇>丙酮>二氯甲烷>石油醚［10］，王文军等分别用二甲基亚砜和丙酮为提取剂从海带中提取岩藻黄质，丙酮提取率优于二甲亚砜结果一致［13］，表明乙醇及丙酮为羊栖菜岩藻黄质提取的良好溶剂。

2.4 单因素对岩藻黄质提取率影响

2.4.1 复合溶剂配比 实验表明乙醇及丙酮对岩藻黄质都能达到较好的效果，但考虑丙酮的毒性及对其它色素如叶绿素类较好的提取效果，因此，选择了复合溶剂配比实验。称取5g预处理过的羊栖菜5份于500mL的三角烧瓶，以液料比为40∶1，分别加入按体积比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的90%乙醇与丙酮为复合溶剂，于60℃恒温水浴锅提取1h。结果如图5所示，随着乙醇所占比例增大，岩藻黄质的提取率逐渐增加;当二者体积比为3∶1时达到峰值，4～5∶1时提取率有下降趋势，即乙醇和丙酮两者复合溶剂极性与岩藻黄质的极性相近时，根据相似相溶原理，同样条件下岩藻黄质提取率达到最高。实验表明为减少杂色素的溶出，宜选择乙醇与丙酮体积比为3∶1提取羊栖菜岩藻黄质为最佳溶剂配比。

图4 不同溶剂对羊栖菜岩藻黄质提取的影响

图5 不同溶剂配比对羊栖菜岩藻黄质提取的影响

图6 不同温度对羊栖菜岩藻黄质提取的影响

2.4.3 液料比 实验选择乙醇与丙酮复合溶剂与羊栖菜藻体的液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1五个水平为考察对象，按照上述方法进行单因素实验，比较岩藻黄质提取率，结果如图7所示。实验表明随着液料比的增大，岩藻黄质提取率逐渐升高，至液料比超过50∶1后，岩藻黄质提取率增加趋于平缓，而且提取液颜色绿色加深;一定的液料比有助于岩藻黄质的提取，但至一定的溶剂量时岩藻黄质已能较完全提取。丙酮常用于提取总色素，故随溶剂量中丙酮量增加，羊栖菜中叶绿素溶出较多。因此，羊栖菜藻体实验中岩藻黄质的提取液料比应考虑50∶1左右为宜。

图7 不同液料比对羊栖菜岩藻黄质提取的影响

2.4.4 提取时间 实验以30、40、50、60、70min五个水平提取时间为考察对象，按上述方法进行单因素实验，结果如图8所示。随着提取时间的延长，岩藻黄质提取率逐渐增大，但变化不明显，超过60min后增幅减小。本实验结果与王文军等［13］以湿海带为原料，二甲基亚砜溶剂提取的单因素实验结果趋势一致，超过60min后岩藻黄质增幅下降;肖策［10］报道以海带干粉为原料，乙醇、丙酮、石油醚复合溶剂提取岩藻黄质单因素实验表明，时间超过1.5h后提取液的吸光值增幅下降，因此，说明真空冰冻干燥藻体中岩藻黄质色素较容易提取，而且省时省溶剂。

图8 不同时间对羊栖菜岩藻黄质提取的影响

2.4.5 提取次数 实验选择不同提取次数进行羊栖菜藻体中岩藻黄质提取单因素实验，每次提取60min，结果岩藻黄质提取率如图9所示。当提取次数达到2次时，羊栖菜藻体中岩藻黄质的提取率已达0.988mg/g，加大提取次数，提取率增幅很小，与肖策［10］提取次数的实验结果一致。因此，从节约成本考虑，羊栖菜藻体提取岩藻黄质宜选择2次为宜。

图9 不同次数对羊栖菜岩藻黄质提取的影响

2.5 岩藻黄质最佳工艺条件确定

根据单因素实验结果，真空冷冻羊栖菜藻体为原料、90%乙醇∶丙酮(3∶1)、提取2次的条件基础上，以岩藻黄质提取率为指标，选取温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)3个因素3水平进行L9(33)正交实验，各组合实验重复三次，结果见表2。

表2 正交实验方案与结果

表3 方差分析表

正交实验方差分析表明，从极差结果得出影响乙醇与丙酮复合溶剂提取羊栖菜藻体中岩藻黄质提取的因素大小依次为RA>RB>RC，即为浸提水浴温度>提取时间>液料比。表3方差分析表明，温度对复合溶剂提取羊栖菜岩藻黄质提取率的影响极显著(P≤0.01);时间、液料比对岩藻黄质提取率均不显著。主要原因为羊栖菜湿藻体经冰冻真空干燥后，藻体细胞容易破裂，岩藻黄质较容易被溶出。因此，从表中数据可以看出，最佳提取条件为A3B3C2。由于岩藻黄质受高温易异构化，综合考虑工艺条件选择为A2B3C2，即90%乙醇和丙酮体积比3∶1混合为提取剂，液料比40∶1，65℃水浴加热提取两次，每次80min。此条件下验证羊栖菜藻体原料提取岩藻黄质提取率达1.067mg/g(藻体干重约5.65%水分)，粗品得率1.02%，其中粗品中含岩藻黄质约13.02%。

3 结论

从羊栖菜褐藻中提取岩藻黄质色素选用乙醇和丙酮溶剂具有较好的效果，并表明岩藻黄质为脂溶性色素，易溶于低极性有机溶剂，少量溶于石油醚，不溶于水。从羊栖菜海藻中提取岩藻黄质的最佳工艺:选择真空冷冻干燥藻体粉(水分约5%左右)，90%乙醇和丙酮体积比3∶1复合溶剂为提取剂，在液料比40∶1，65℃水浴振荡提取两次，每次80min，其提取率HPLC检测达1.067mg/g，高于文献报道海带中提取的岩藻黄质的提取率。

实验为羊栖菜岩藻黄质提取总结出了较佳的工艺参数，为后续工业化生产奠定了基础。所提取的岩藻黄质粗品含有叶绿素和β－胡萝卜素等其它色素物质，应进一步纯化分离，以满足市场上对岩藻黄质的不同功能产品开发应用所需纯度需求。

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Study on extracting process of fucoxanthin from Sargassum fusiforme

YIN Shang－jun，XU Tao，LIU Li－ping，WANG Cai－sheng*，QIAN Guo－ying
(College of Biological and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China)

HPLC was used to determine the extraction efficiency of fucoxanthin from vacuum freezing Sargassum fusiforme，and the solvent or process extraction parameter were optimized by determining the extraction efficiency in the present study.The results showed that the optimal procedure was obtained when ratio of 90%ethanol to acetone

(v∶v)was 3∶1，ratio of solvent to dry flower was 40∶1，and horizontal shaking bath was at 65℃ for two times(80min for each time).The extraction efficiency of fucoxanthin，crude product yield and purity were 1.067mg/g(dry weight basis)，1.02%and around 13.02%respectively.The present study provided processing information and new resource for product development of Fucose zeaxanthin pigment.

Sargassum fusiforme;fucoxanthin;extracting process

TS254.1

B

1002－0306(2011)04－0272－04

2010－11－17 *通讯联系人

尹尚军(1968－)，女，副教授，主要从事植物生理生化的研究。

宁波市海洋渔业局基金甬财政［2006］603号/甬海［2006］160号。