猪 K88 、K99 、987P、F41 埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

巫月生,齐冬梅,张毓金,赖月辉,李嘉爱,王卓明

(广东永顺生物制药有限公司,广州萝岗 511356)

仔猪大肠杆菌性腹泻是由产肠毒素埃希氏大肠杆菌(ETEC)引起的哺乳仔猪急性肠道传染病,新生仔猪 ETEC的 4个重要的黏附素是 F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和 F41[1],其是引起初生仔猪腹泻(即仔猪黄痢)的关键因素[2],临床表现为仔猪出生后 1～3 d感染,引起剧烈腹泻而迅速死亡,死亡率高达 100%。本病对初建种猪场的初产母猪的仔猪危害较大,多年来,国内有关研究单位已开发了单价灭活苗,二价基因工程苗,三价菌毛灭活苗及多价灭活菌苗[3-4],但都存在使用覆盖面窄或免疫原性差,效价不稳定等问题。疫苗效价很大程度上取决于疫苗中有效抗原的量,菌毛抗原是致病性大肠杆菌主要抗原成分,已知菌毛抗原表达除与菌株、培养基等有关[5]外,培养方法亦至关重要,本研究选择含 K88、K99、987P、F41的四株猪埃希氏大肠杆菌,采用高密度发酵培养方法表达菌毛抗原取得了较好效果,为制备高效疫苗打下基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 猪埃希氏大肠杆菌 C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)、C83707(F41)四株菌均由广东永顺生物制药有限公司研发部保存、提供。

1.2 血清 K88、K99、987P、F41标准血清,购自中国兽医药品监察所。兔抗 K88、K99、987P、F41四株菌毛抗原血清均由广东永顺生物制药有限公司研发部制备并保存。

1.3 培养基及其他试剂 普通琼脂、改良 Minca琼脂、改良 Minca汤、葡萄糖液、2M氨水、2M HCl等,均按常规方法配制。

1.4 抗体致敏绵羊红血球 参照《实用免疫学》[6]间接血凝试验方法制备。

1.5 试验用主要设备、仪器 BIOSTATR○C22型全自动生物发酵罐,容积 22 L,购自德国贝朗B.Braun公司；紫外 -可见光光度计(Ultrospe 3300pro),购自 Amersham Pharmacia Biotech公司；pHS-3C数字式 pH计,购自上海雷磁仪器厂。

1.6 种子的制备 将各株菌种分别接种在改良Minca琼脂平板上,37℃培养 18 h,选取灰兰色、半透明、圆整、凸起、湿润和边缘整齐的典型菌落,做平板凝集,应达到 ++++(判定方法参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》[7]凝集反应强度标准),并再接种到改良 Minca琼脂扁瓶,37℃培养18 h,用改良 Minca汤洗下,做平板凝集,达到 ++++,经纯检合格后作基本种子液。

1.7 菌液培养

1.7.1 高密度发酵培养 将占高密度发酵罐 2/3至 3/4容积的改良 Minca汤及适量的消泡剂加入罐体中,116℃消毒 30 min。消毒完毕后待罐内培养基温度降为 37℃时,保持 12～24 h进行无菌检验。无菌检验合格后接入种子液,在培养过程中,通过高密度发酵罐自动补入葡萄糖液,用 2 mol/L氨水与 2mol/LHCl调节酸碱度,使其保持适宜的pH值和细菌快速分裂生长繁殖所需的营养成分,培养时温度始终维持在 37℃,并控制一定通气量和搅拌速度。

1.7.2 普通深层通气培养[8]培养基及其装量、种子液、pH值等与前面 1.7.1相同,对 K88、K99、987P、F41四株菌采用传统普通 20 L玻璃瓶深层通气培养,在培养过程中,只通入相同的气量,温度始终维持在 37℃。

1.8 培养液检测 规定接种后开始培养时的时间为 0 h,以后每隔 1 h取样一次,所取的样品分别用紫外 -可见光光度计(Ultrospe 3300pro)测 OD值(λ=525 nm)；用 pHS-3C数字式 pH计测 pH值。培养结束时,并用倾注平板培养法[9]测活菌数和用96孔板做反向间接血凝试验(RIHA)[6]测效价。而对于普通深层通气培养,只在其培养结束时测定活菌数和效价。

2 结 果

2.1 四株菌培养不同时间各参数测定结果 K88、K99、987P、F41四株菌采用两种不同培养方法培养,测得其培养液在不同时间的活菌数、OD值、pH值、效价,如表 1所示。

2.2 四株菌高密度发酵培养生长曲线的测定结果以菌液的 OD值为纵坐标,以生长时间为横坐标,描绘出高密度发酵培养菌液的 OD值与时间的关系曲线,如图 1所示。

表 1 四株菌培养不同时间的活菌数、OD值、pH值、RIHA效价测定的结果

图 1 四株菌高密度发酵培养菌液的OD值与时间的关系曲线

2.3 高密度发酵与普通深层通气培养比较试验结果 K88、K99、987P、F41四株菌采用高密度发酵与普通深层通气两种方法培养结束时,所需时间及培养液的活菌数与效价,如表 2所示。

表 2 四株菌用不同方法培养结束时间、菌液的活菌数及效价比较

3 讨 论

3.1 一般细菌发酵培养,随着培养时间延长,反映细菌浓度的 OD值增高,细菌代谢产物也相应增多,其 pH值发生变化的同时抑制细菌本身增殖。高密度发酵培养能自动调节罐内的营养成分及酸碱度,尽管随着营养成分消耗及代谢产物增加,其pH值基本稳定在 7.0～7.2,这样就可使细菌处于适宜的环境中快速分裂生长,呈对数生长的菌数大幅度增加,在短时间(7～8 h)内就可达到细菌生长繁殖的高峰期,病原菌在此时,其致病力最强[10],抗原表达量亦较高。

3.2 高密度发酵培养 7～8 h,活菌数为 4.1×1010～4.9×1010CFU/m L,效价高达 211～213；而采用普通深层通气培养 13～14 h,活菌数为 0.51×1010～0.59×1010CFU/m L,效价为 24～25。说明无论是活菌数或是抗原表达量(即效价),前者培养方法都远优于后者。所以采用高密度发酵培养技术不但减少培养时间,而且能很好地增加单位抗原量,便于大批量生产。

3.3 本试验高密度发酵培养结果是根据 K88、K99、987P、F41四菌株培养至 7～8 h或 6～7 h菌液的 OD值变化不大时进行收获的,培养更长时间未作试验,效价是否会随着培养时间的延长还会提高,有待进一步探讨。

3.4 四菌株培养至结束时,OD值均比较稳定,此时细菌活菌数亦高,培养中当 OD值达到稳定值时,可能就是细菌生长高峰期。因此,细菌培养过程中,可否以测定 OD值在其稳定时段作为依据来确定终止培养,此外,用不同 OD值表示抗原量与对动物免疫反应等的相关问题还有待进一步研究。

[1] Barbara EStraw,Jeffery JZimmerman,Sylvie D,Allaire,等.猪病学[M].赵德明,张仲秋,沈建忠,译.第 9版.北京：中国农业大学出版社,2008：724.

[2] 雷梦珍,郭湘霞.仔猪大肠杆菌性腹泻 K88,K99,987P三价灭活苗的免疫效果[J].中国兽医杂志,1995,29(2)：6.

[3] 戴鼎震,李 鹏,周长锋,等.仔猪黄痢K88-K99-987P-F41多价菌毛混合油乳剂灭活疫苗的制备及小鼠免疫保护试验[J].江苏农业科学,2003,(1)：55.

[4] 孙 宇,沈玉春.仔猪大肠杆菌 K88-ST1-LTB三价基因工程灭活疫苗的应用实验[J].中国兽药杂志,2002,36(9)：35-36.

[5] 陈 雷,成大荣,徐建生,等.大肠杆菌 F1菌毛表达条件的初探[J].中国兽药杂志,2000,34(10)：10-13.

[6] 杨正彬、伊学念.实用免疫学[M].吉林：长春出版社,1994：403-406.

[7] 中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品质量标准二○○一年版[S].

[8] 巫月生,吴文福,李嘉爱,等.猪大肠杆菌(K88)菌株的生长规律的探讨[J].广东畜牧兽医,2001,(5)：29-31.

[9] 王明俊.兽医生物制品学[M].北京：中国农业出版社,1996：296.

[10]陆承平.兽医微生物学[M].第三版.北京：中国农业出版社,2001：27.