小麦种子过氧化物酶WP1基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

单丽伟，唐如春，刘三阳，范三红,2，郭蔼光,2

1 西北农林科技大学生命科学学院，杨凌 712100

2 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100

小麦种子过氧化物酶WP1基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

单丽伟1，唐如春1，刘三阳1，范三红1,2，郭蔼光1,2

1 西北农林科技大学生命科学学院，杨凌 712100

2 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100

WP1是小麦种子中最主要的阳离子过氧化物酶，该酶不仅参与种子的发育过程，而且影响面粉的加工品质。首先构建了WP1基因原核表达载体pET28a-WP1，并将其转化到T7 Expression大肠杆菌菌株中诱导表达。His-tag融合的WP1主要以包涵体形式存在，使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化，获得纯度大于98%的重组蛋白。重组WP1经尿素梯度透析复性溶解后免疫新西兰大白兔，最终获得WP1多克隆抗体。ELISA分析结果显示制备的WP1兔抗血清的效价大于1∶625 000；Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对WP1具有很好的专一性。

小麦，种子过氧化物酶，WP1，表达纯化，抗体制备

Abstract:Wheat peroxidases 1 (WP1) is the major cationic peroxidase of wheat (Triticum aestivum) grain, which is involved in the development of seeds and an important factor to affect the final processing quality of flour. We constructed a prokaryotic expression vector pET28a-WP1, and transformed it into E. coli host strain T7 Expression. His-tag fused WP1 existed as inclusion body, and the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography under denatured condition. The purity of target protein reached 98%. The recombinant WP1 was refolded by gradient urea dialysis, then used as antigen to immune rabbit to prepare polyclonal antibody. The result of ELISA showed that the titer of rabbit anti-WP1 antiserum was higher than 1:625 000. The result of Western blotting demonstrated that the prepared WP1 polyclonal antibody could be used to detect WP1 with high specificity.

Keywords:Triticum aestivum, grain peroxidase, WP1, expression and purification, antibody preparation

过氧化物酶同工酶广泛存在于各种植物中，它们参与了植物体内许多重要的生理过程，如木质化和栓化、激素代谢、细胞壁蛋白质交联、病原防御、耐盐及抗氧化等[1]。植物过氧化物酶不仅在植物的生长发育和环境响应过程中发挥重要作用，而且作为重要的商品酶应用于生物催化、临床检测和生物技术研究等领域。如高分子材料的生产、有毒芳香化合物废水的处理、基于ELISA的疾病诊断等[2-3]。

面粉是众多食品加工的主要原料，如何改善面粉的加工性能是当前小麦育种和食品加工领域的研究热点。育种研究者希望通过改变面粉中各种组分的含量改变面粉的加工性能，而食品加工研究者则希望通过在面粉中添加外源添加剂改变面粉的性质。已有研究结果显示，面粉中谷蛋白和醇溶蛋白的组成和含量、过氧化物酶活性、脂过氧化物酶活性、二硫键异构酶活性、谷胱甘肽含量等均会不同程度影响面团的特性，添加化学氧化剂、添加外源过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶等均能改变面团的功能特征[4-6]。

1995年Converso等从小麦种子中纯化到3种阳离子过氧化物酶组分，其中2种组分的理化性质和催化特性接近，而第3种与前两者差异较大[7]；2001年 Caruso等从面粉中纯化到一种阳离子过氧化物酶，将其命名为WP1，并证明其具有抗真菌活性[8]；2002年Yamashita等从面粉中纯化到一种36 kDa阳离子过氧化物酶[9]，分析了其 N-末端序列，发现该蛋白存在糖基化现象，糖基主要为甘露糖和岩藻糖。本研究组从面粉中纯化到一种阳离子过氧化物酶(WP1)[10]，并克隆了该酶对应的基因，质谱分析结果显示其与大麦种子过氧化物酶BP1高度同源，并对其理化性质进行了系统分析。结合前人和我们的实验结果可知，小麦种子中存在非常强的过氧化物酶活力，WP1是小麦种子中最主要的阳离子过氧化物酶；应该参与种子的成熟过程，存在于面粉中的WP1应该对面团形成具有显著影响，但是WP1参与种子的成熟和面团形成的机制目前尚不清楚。

本研究将小麦 WP1基因克隆到原核表达载体pET28a，利用大肠杆菌系统表达并纯化获得重组WP1。使用重组蛋白免疫兔子，制备获得小麦WP1多克隆抗体，并对多克隆抗体的效价和专一性进行了分析。为WP1的组织和细胞定位、在种子形成过程中的功能及其对面粉加工性能的影响等研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、2-log DNA ladder、蛋白 marker等为 NEB公司产品；Ni-NTA Superflow agarose纯化介质为 Qiagen公司产品；PVDF (聚偏二氟乙烯膜) 转印膜为 GE公司产品；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为Pierce公司产品；HRP标记的羊抗兔抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；HRP-DAB显色试剂盒购自北京Tiangen公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.1.2 菌株与载体

大肠杆菌 DH5α和表达菌株 T7 Expression为NEB公司产品；pET28a表达载体为 Novagen公司产品；含有WP1基因cDNA的pPCR-WP1质粒为本实验室保存。

1.1.3 实验动物

2只新西兰大耳白兔，体重约2 kg。

1.2 方法

1.2.1 表达载体构建

以含有WP1基因cDNA的质粒pPCR-WP1为模板，P1、P2为引物，通过PCR扩增获得目的片段，回收的 PCR产物经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连入pET28a表达载体，转化大肠杆菌DH5α，获得的重组质粒经双酶切和PCR鉴定后，送上海生工生物工程有限公司测序。所用引物序列如下：P1：5′-AT GGAATTC GCGGAGCCTCCGGTGGCGCGC-3′，P2:5′-ATGAAGCTT CTAGCCAAGCCTTTCTGCAGC-3′。

1.2.2 融合蛋白的表达

将表达载体 pET28a-WP1导入大肠杆菌 T7 Expression表达菌株，在含有50 μg/mL卡那霉素平板上筛选，挑取单菌落，在含有50 μg/mL卡那霉素LB液体培养基中37 ℃培养至对数生长期，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG (终浓度为0.5 mmol/L) 诱导。4 ℃、10 000×g 离心5 min收集菌体，5 mL菌液沉淀用 1 mL裂解缓冲液 (50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑) 重悬，经超声破碎，分别取裂解菌液及离心后上清液，利用15% SDS-PAGE进行分离检测。

1.2.3 融合蛋白的亲和纯化

收集100 mL诱导表达后的菌体，加入10 mL裂解缓冲液重悬后超声破碎，离心收集沉淀。用裂解缓冲液洗涤沉淀 3次去除可溶性蛋白，然后再用含0.1% Triton X-100的裂解缓冲液洗涤3次去除膜蛋白。用含有8 mol/L 尿素的裂解缓冲液溶解获得的包涵体，4 ℃、10 000 × g离心20 min，将上清载入Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱，用5倍柱体积的漂洗缓冲液 (50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 6.3) 洗柱以除去杂蛋白，最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液 (100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 5.9) 洗脱目的蛋白。收集洗脱组分，利用 15%SDS-PAGE进行分离检测。使用 Bio-Rad 公司的Quantity one软件分析目的蛋白的相对量。

1.2.4 兔抗WP1血清的制备

依次用含 4、2、l、0.5、0.2 mol/L 尿素的 10 mmol/L磷酸盐缓冲液透析复性，然后与等体积弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合乳化后皮下多点注射，分4次进行免疫。首次按800 μg/只剂量免疫，皮下6点注射；第 21、35、49天分别按 400 μg/只剂量免疫，皮下4点注射。每次免疫10 d后，每只兔子耳缘静脉取血0.5~1 mL，分离抗血清，间接ELISA检测免疫后血清效价。第60天时采全血，分离抗血清，−20 ℃保存，ELISA检测血清效价。

1.2.5 Western blotting检测

取开花后15 d的小麦籽粒2 g，液氮中研磨后加入5 mL蛋白质提取液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，1% 2-巯基乙醇，1 mmol/L PMSF)，充分研磨匀浆，10 000×g离心15 min后取上清，加蛋白上样缓冲液，利用 15% SDS-PAGE进行分离，再通过电转印仪转印至Hybond-P PVDF膜上。以方法1.2.4中制备的兔抗血清为一抗 (1∶50)，用辣根过氧化物酶标记(HRP) 的羊抗兔抗体为二抗 (1∶2 000)，进行Western blotting检测。

2 结果与分析

2.1 pET28a-WP1表达载体的构建

以质粒pPCR-WP1为模板，通过PCR扩增WP1基因编码区 (不包含信号肽区，共996 bp)，将其重组入表达载体 pET28a。图 1为重组质粒 PCR和EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定结果，第1和2泳道均出现约1 000 bp的预期片段。将酶切鉴定正确的质粒进行测序，序列正确的重组质粒命名为pET28a-WP1。

图1 重组质粒pET28a-WP1的双酶切和PCR鉴定Fig. 1 Identification of recombinant vector pET28a-WP1 by double digestion and PCR. M: DNA marker; 1: pET28a-WP1 digested with EcoRⅠ and Hind ; 2: Ⅲidentification of pET28a-WP1 by PCR.

2.2 WP1融合蛋白的表达与纯化

将构建的表达载体 pET28a-WP1转化大肠杆菌T7 Expression 菌株，挑取单菌落接种于LB培养基，培养至对数生长期时加IPTG诱导，分别收集诱导2、4、6 h后样品，使用15% SDS-PAGE分析表达量随时间变化，结果如图2A所示。与对照泳道相比，泳道2、3、4都出现与预期大小一致的37 kDa条带，且其表达量随诱导时间而增加；诱导 4 h后，WP1即达到最大表达量。可溶性分析结果显示，重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。将包涵体溶解于8 mol/L尿素溶液中，通过Ni-NTA琼脂糖亲和柱分离，最终获得用于抗体制备的重组WP1。泳道灰度扫描分析结果显示，重组蛋白纯度大于98%，如图2B所示。

图 2 WP1在大肠杆菌中不同时间的表达情况及其分离纯化的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression of WP1 in different time and purification through Ni-NTA agarose affinity chromatography. (A) M: prestained protein marker; 1:un-induced control; 2−4: the expression of WP1 after 2, 4, 6 h induction respectively. (B) M: prestained protein marker; 1: total protein; 2: soluble protein after inducing; 3: the purified WP1.

2.3 间接ELISA法检测抗血清效价

使用2 μg/mL的WP1抗原包被酶标板，5%脱脂奶粉封闭，将抗血清或免疫前血清按稀释度1∶1 000、1∶5 000、1∶25 000、1∶125 000、1∶625 000稀释后加入酶标板中孵育，洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔二抗，最后以四甲基联苯胺 (TMB) 为底物进行显色，用酶标仪测450 nm波长的光吸收值。每个稀释度重复3次，测定结果如图3所示，每一点的标准差用垂直短线表示。以OD阳/OD阴＞2.1为标准，制备的WP1兔抗血清效价在1∶625 000以上。

图3 ELISA测定WP1兔抗血清效价Fig. 3 Titer of rabbit anti-WP1 antiserum was detected by ELISA.

2.4 Western blotting检测

为了检测制备的WP1抗血清的特异性，提取小麦籽粒中的可溶性蛋白，利用 15% SDS-PAGE分离，蛋白印迹后依次用WP1抗血清 (一抗) 和HRP山羊抗兔抗体 (二抗) 杂交，以二氨基联苯胺 (DAB)为底物进行显色，结果如图4所示。图4A为蛋白电泳结果，图4B为Western blotting结果。图4A中，第1泳道为重组的WP1，第2、3泳道分别为从“陕225”和“郑农 16”小麦种子中提取到的可溶性蛋白；图4B中，每个泳道中均出现一条约37 kDa的特异条带，说明WP1抗血清不仅能与重组WP1特异结合，而且可以很好地识别小麦籽粒中的WP1。已有研究显示小麦种子中的可溶蛋白中包含多种过氧化物同工酶，而 WP1抗血清与种子总蛋白杂交时仅出现一条带，证明其对 WP1具有良好的专一性。

图4 Western blotting检测抗血清的特异性Fig. 4 Western blotting analysis the specificity of antiserum.(A) SDS-PAGE analysis. (B) Western blotting analysis. M:prestained protein marker; 1: the purified WP1 protein; 2, 3: the total soluble protein from wheat grain of Shan 225 and Zheng Nong16.

3 讨论

制备抗体首先需要获得高纯度的目的蛋白。本研究将小麦WP1基因通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ切点整合入pET28a载体，然后导入大肠杆菌T7 Expression菌株诱导表达。目的蛋白融合有 His标签，融合蛋白以包涵体形式存在。首先用裂解缓冲液反复洗涤除去可溶性蛋白，然后用含0.1% Triton X-100的裂解缓冲液洗涤去除膜蛋白，经过上述方法获得包涵体纯度可达95%以上。为了获得纯度更高的重组蛋白，研究中使用尿素溶液溶解包涵体，然后使用Ni-NTA琼脂糖亲和介质在变性条件下进一步纯化，最后获得纯度高于98%的重组WP1。蛋白质是否变性是影响最终抗血清效价的重要因素。本研究制备的重组蛋白以变性形式溶解于8 mol/L尿素中，制备抗体时，首先将其逐级透析去除尿素，使目的蛋白最大程度复性，与佐剂等体积混合后免疫兔子，本研究获得的抗血清效价高达1∶625 000。

抗体对抗原蛋白的专一性对抗体应用非常重要。植物过氧化物酶是一个超家族，一个物种中通常存在几十种到上百种过氧化物酶同工酶，如拟南芥全基因组中共有73个过氧化物酶基因[11]，水稻中共有138个过氧化物酶基因[12]。确定WP1多克隆抗体是否只与WP1特异反应而不与其他过氧化物酶同工酶结合对WP1抗体的应用非常关键。本实验中提取了小麦种子可溶性总蛋白，通过Western blotting检测WP1多克隆抗体的专一性，结果只出现一条特异条带，因而制备的WP1多克隆抗体具有非常好的特异性。这为利用该抗体进行WP1的组织和细胞定位、分析不同小麦品种中WP1含量和加工性能关系等研究奠定了基础。

REFERENCES

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Prokaryotic expression, purification and preparation of polyclonal antibody for wheat grain peroxidase WP1 gene

Liwei Shan1, Ruchun Tang1, Sanyang Liu1, Sanhong Fan1,2, and Aiguang Guo1,2

1 College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
2 Key Laboratory of Agricultural Molecular Biology in Shaanxi Province, Yangling 712100, China

Received: March 16, 2010; Accepted: May 20, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30300222).

Corresponding author: Sanhong Fan. Tel/Fax: +86-29-87092262; E-mail: sanhong.fan@gmail.com Aiguang Guo. Tel/Fax: +86-29-87092262; E-mail: guoaiguang@yahoo.com.cn

国家自然科学基金 (No. 30300222) 资助。

Received: April 12, 2010; Accepted: July 19, 2010

Supported by: Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2006BAD06A08).

Corresponding author: Baoan Cui. Tel/Fax: +86-371-63558878; E-mail: baoancui@henau.edu.cn

国家“十一五”科技支撑计划 (No. 2006BAD06A08) 资助。