江南卷柏脱氢抗坏血酸还原酶的分子特性

成子硕，兰婷，李迪，杨海灵，曾庆银

1 中国科学院植物研究所 系统与进化植物学国家重点实验室，北京 100093

2 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083

3 中国科学院研究生院，北京 100049

江南卷柏脱氢抗坏血酸还原酶的分子特性

成子硕1,3，兰婷1,3，李迪2，杨海灵2，曾庆银1

1 中国科学院植物研究所 系统与进化植物学国家重点实验室，北京 100093

2 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083

3 中国科学院研究生院，北京 100049

脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR) 在植物抗坏血酸−谷胱甘肽循环中发挥着重要作用。利用同源克隆技术从江南卷柏中克隆到2个脱氢抗坏血酸还原酶基因，分别命名为SmDHAR1和SmDHAR2。SmDHAR1和SmDHAR2分别编码218和241个氨基酸，预测分子量分别是23.97 kDa和27.33 kDa。基因组序列分析显示这2个基因分别含有5和6个内含子。器官表达模式分析发现这 2个基因在根、茎、叶中均有表达，是组成型表达基因。在大肠杆菌中表达并纯化了2个基因的重组蛋白。酶活性分析显示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白对底物DHA的活性有显著差异，分别是19.76和0.17 μmol/(min·mg)。热力学稳定性分析显示这2个重组蛋白的热力学稳定性具有明显差异。因此，基因结构与酶学性质的差异预示着这2个基因可能存在功能上的分化。

江南卷柏，脱氢抗坏血酸还原酶，克隆，蛋白表达，酶活

Abstract:Plant dehydroascorbate reductase (DHAR) is a physiologically important reducing enzyme in the ascorbate-glutathione recycling reaction. In this study, two DHARs genes (SmDHAR1 and SmDHAR2) were isolated from Selaginella moellendorffii. The SmDHAR1 and SmDHAR2 genes encode two proteins of 218 and 241 amino acid residues, with a calculated molecular mass of 23.97 kDa and 27.33 kDa, respectively. The genomic sequence analysis showed SmDHAR1 and SmDHAR2 contained five and six introns, respectively. Reverse transcription PCR revealed that the SmDHAR1 and SmDHAR2 were constitutive expression genes in S. moellendorffii. The recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2 proteins were overexpressed in E. coli, and were purified byNi-affinity chromatography. The recombinant SmDHAR1 showed 116-fold higher enzymatic activity towards the substrate dehydroascorbate than recombinant SmDHAR2. The recombinant SmDHAR1 showed higher thermal stability than recombinant SmDHAR2. These results indicated obvious functional divergence between the duplicate genes SmDHAR1 and SmDHAR2.

Keywords:Selaginella moellendorffii, dehydroascorbate reductase (DHAR), cloning, protein expression, enzyme activity

还原型抗坏血酸 (Ascorbic acid，AsA) 是植物体内普遍存在的一种小分子抗氧化物质，可清除由光合作用、呼吸作用等氧化反应产生的超氧自由基、过氧化氢、单线态氧、羟自由基等活性氧自由基[1]，并被氧化成单脱氢抗坏血酸 (MDA)。MDA进一步自氧化形成双脱氢抗坏血酸 (DHA)，DHA在脱氢抗坏血酸还原酶 (Dehydroascorbate reductase，DHAR，EC 1.8.5.1) 和谷胱甘肽的作用下能还原成还原型抗坏血酸。因此，DHAR对于维持植物细胞中还原型抗坏血酸的水平具有重要意义。此外，DHAR在植物抗逆反应中发挥着重要作用。例如，在转基因拟南芥中过量表达水稻DHAR基因可提高对盐胁迫的抗性[2]；在细胞质中过量表达拟南芥DHAR基因可使转基因马铃薯增强对臭氧和干旱胁迫的抗性[3]；在烟草中过量表达 DHAR基因可以延缓叶片的衰老，同时叶绿素和叶黄素的含量增加[1]。

迄今为止，对DHAR的研究主要集中在拟南芥、小麦、菠菜、水稻等被子植物[4-7]，对于裸子植物，我们先前从白皮松中克隆了1个DHAR基因，并对它的性质进行详细的研究[8]，而对于在进化上更古老的蕨类植物，还没有关于DHAR基因的研究报道。蕨类植物是一种古老的维管植物，化石证据显示它们起源于距今4亿年前，在原始维管植物的进化中具有重要意义[9]。江南卷柏Selaginella moellendorffii Hieron.是蕨类植物的一个现存种，在中国广泛分布于长江流域和长江以南各地[10]，是一种常用的中草药与民族药[11]。本研究从江南卷柏中克隆到 2个DHAR基因，对该基因的基因结构、表达模式、所编码蛋白的结构与生化功能进行了详细的研究，为深入揭示DHAR在植物逆境胁迫中的作用机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

江南卷柏采自重庆晋云山。整株活体带土移植，于光照培养箱 (25 ℃) 培养1周，取其嫩叶用于总RNA的提取。另外分离叶、菱叶、茎和根4个组织RNA，作为组织特异性表达分析材料。

1.2 工具酶和试剂

总RNA提取试剂盒Aurum Total RNA Kit购自Bio-Rad公司，DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒以及DNA maker购自Qiagen公司，反转录试剂盒RNA PCR Kit (AMV) version 3.0、Taq DNA聚合酶和其他PCR试剂购自TaKaRa公司，pGEM-T Easy质粒购自 Promega公司，限制性内切酶购自Invitrogen公司。

1.3 DHAR基因序列的鉴定与命名

根据已知拟南芥 DHAR蛋白序列 (GenBank Accession No. AY039590)，利用 TBLASTN 检索GenBank中江南卷柏的EST数据库，获得的2组序列与拟南芥DHAR序列均具有较高相似性。获得序列经过 Pfam判读，确定该序列编码的蛋白具有DHAR结构域特征。我们将这 2组序列分别命名为SmDHAR1 (GenBank Accession No. FE475698.1) 和SmDHAR2 (GenBank Accession No. FE454714和FE454715)。

1.4 江南卷柏DHAR基因的克隆

取新鲜江南卷柏叶组织0.1 g，按照试剂盒说明书步骤提取江南卷柏的总RNA和基因组DNA，并以总RNA为模板，用Revert Aid First Stand cDNA试剂盒合成cDNA。

根据SmDHAR1和SmDHAR2 EST序列分别设计引物 SmDHAR1-CL1/2、SmDHAR2-CL1/2 (表 1)。引物均由 Invitrogen公司合成。分别以江南卷柏叶cDNA和基因组 DNA为模板，利用 2对引物SmDHAR1-CL1/CL2和SmDHAR2-CL1/CL2分别进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，纯化产物连接到pGEM-T载体上。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。在X-gal/IPTG Amp平板上挑取多个阳性克隆进行双向测序。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 系统发生关系分析

SmDHAR1和SmDHAR2的蛋白序列与其他植物DHAR序列通过 Clustal X 1.83进行氨基酸序列比对，然后经BioEdit手动校对。利用MEGA v.4.0的neighbour-joining(NJ) 模型构建进化树，Bootstrap值为1 000。

1.6 江南卷柏DHAR基因的组织表达分布

为了研究DHAR基因在江南卷柏不同组织中的表达分布，按照试剂盒说明书步骤提取江南卷柏叶、菱叶、茎和根组织的总 RNA，并以总RNA为模板反转录合成cDNA。根据SmDHAR1和SmDHAR2的基因序列分别设计 1对特异性引物 SmDHAR1-SP1/2和 SmDHAR2-SP1/2 (表 1)，进行 RT-PCR扩增，在进行PCR扩增时，模板cDNA上样量为3 µL，并且以江南卷柏 Actin基因作为内标。PCR反应程序是：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸2 min。在PCR反应中以含有目的基因的pGEM-T载体作为阳性对照，以不加任何cDNA模板的PCR反应液作为阴性对照，PCR结束后进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳上样量为2 µL，为了进一步验证所扩增到的是否为目的基因，对PCR产物进行测序。

1.7 江南卷柏DHAR基因表达载体的构建、融合蛋白的表达与纯化

根据SmDHAR1和SmDHAR2的cDNA序列设计引物 SmDHAR1-EX1/2和 SmDHAR2-EX1/2 (表1)，以江南卷柏叶cDNA为模板分别进行PCR扩增。PCR产物经酶切回收，连接到带 6×His标签的PET30a表达载体中，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中。将测序验证无突变的重组表达菌于含卡那霉素的LB培养基中培养过夜，以1∶100稀释后扩大培养至OD600为0.5，加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L，37 ℃过夜诱导。诱导表达后的菌液4 ℃、6 500×g离心10 min收获菌体，缓冲液A (20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 重悬，冰上超声破碎裂解。4 ℃、10 000 g离心10 min，取少量原菌液、超声破碎后离心上清液和沉淀经SDS-PAGE检测具有目的蛋白峰带，SDS-PAGE检测采用 10%的分离胶，5%的浓缩胶。用缓冲液 A平衡Ni柱 (购自于Amersham Pharmacia Biotech公司)，将超声破碎后离心上清液上样，以缓冲液A平衡亲和柱，用缓冲液B (0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 洗脱目的蛋白，收集目的蛋白洗脱峰进行下一步酶学活性分析。

1.8 江南卷柏DHAR蛋白的酶学活性和热力学稳定性测定

植物 DHAR类基因是植物谷胱甘肽转移酶(GST) 超家族的一个亚类型，本实验对GST常见底物CDNB (Including 1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 的活性测定参照Habig等[12]的方法，对NBD-Cl (7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole) 的催化活性测定参照Ricci等[13]的方法，对DHA (Dehydroascorbate) 的催化活性测定参照 Edwards等[14]的方法。酶热力学稳定性的测定方法是先将酶在指定温度下保温15 min，在保温结束后检测酶对DHA底物的催化活性。

1.9 江南卷柏DHAR蛋白结构模拟

选取线虫EXC-4蛋白 (PDB: 2yv9A) 的X衍射晶体结构为模板，以 Align 2D程序 (InsightⅡ的Homology模块) 进行序列比对，运用 InsightⅡ的Modeler模块构建蛋白质三维结构，产生10个结构，每个结构产生 10个不同的环区结构，优化水平为高等，以Profiles-3D对各结构进行评价，选取最优结构。

2 结果与分析

2.1 江南卷柏DHAR基因的系统发生关系分析

选取5个代表不同进化历史的陆地植物物种的DHAR基因为研究对象，包括苔藓植物小立碗藓Physcomitrella patens、蕨类植物水蕨 Ceratopteris richardii、裸子植物白云杉Picea glauca、单子叶植物水稻 Oryza sativa和双子叶植物拟南芥Arabidopsis thaliana。另外DHAR基因被证明是GST基因家族的成员，在系统发育分析中，植物GST基因家族其他类型，包括 Tau、Phi、Lambda、Theta和Zeta GSTs序列也同时进行系统发育分析。系统发育树显示所有DHAR基因聚成一大支，而且有着大于98%的支持率 (图1)。我们发现这些DHAR基因聚成 2小支 (D1和 D2，图 1)，SmDHAR1和SmDHAR2分别聚在D1支和D2支中，另外每一小支都有小立碗藓和白云杉DHAR基因，这说明在陆地植物形成的早期，DHAR基因发生了一次古老的基因重复事件，在这次基因重复事件中产生的 2个重复基因拷贝在江南卷柏中被保留了下来。

图1 江南卷柏DHAR基因的系统发育分析Fig. 1 Phylogenetic tree showing relationships between SmDHAR and other classes of plant GSTs.

2.2 江南卷柏DHAR基因的克隆与基因结构分析

以江南卷柏叶cDNA以及基因组DNA为模板，引物SmDHAR1-CL1/CL2分别克隆到SmDHAR1的cDNA与基因组序列 (图2A)。SmDHAR1 cDNA序列包括657 bp的开放阅读框 (包括终止密码子)、60 bp上游非编码序列和68 bp下游非编码序列。cDNA编码 218个氨基酸的蛋白，预测分子量为23.97 kDa。SmDHAR1基因组序列长1 123 bp，包括5个内含子，内含子长度分别为61、53、72、67和85 bp (图 2A)。

引物 SmDHAR2-CL1/CL2分别克隆得到SmDHAR2的 cDNA 与基因组序列 (图 2B)。SmDHAR2 cDNA序列包含726 bp的开放阅读框 (包括终止密码子)，60 bp上游非编码区和35 bp下游非编码区。cDNA编码的蛋白包含241个氨基酸，预测分子量为27.33 kDa。SmDHAR2基因组序列长1 220 bp，包括6个内含子，长度分别为68、59、58、60、78 和 76 bp (图 2B)。

2.3 江南卷柏DHAR基因的组织表达模式分析

通过RT-PCR研究江南卷柏DHAR基因在正常生长下不同组织 (叶、菱叶、茎和根) 中的表达分布。RT-PCR后对 PCR产品进行测序，测序结果表明SmDHAR1和SmDHAR2基因在江南卷柏所有组织中均表达 (图3)，这表明2个DHAR基因是组成型表达基因，可能在江南卷柏的生长发育中发挥着重要作用。

图2 SmDHAR1 (A) 和SmDHAR2 (B) 的核酸及推导的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SmDHAR1 (A) and SmDHAR2 (B). The intron sequence is in lower case. The extron sequence is marked in gray. The stop codon is denoted by an asterix.

图3 江南卷柏DHAR基因在不同组织中的表达模式Fig. 3 Expression of the SmDHAR1 and SmDHAR2 gene in various tissues of S. moellendorffii. 1−4: leaf, scale leaf, stem and root tissues. +: positive control using the pGEM-T constructs including target genes as PCR template; −: negative control using RT-PCR reaction without template.

2.4 江南卷柏DHAR蛋白的三维结构模建

图4A展示了模拟的2个江南卷柏DHAR蛋白的三维结构。优化后的构象用 Profile-3D进行氨基酸残基的兼容性考察，结果如图4B所示，从图中可以看到大部分氨基酸残基得分都是正值，位于合理的范围。SmDHAR1和SmDHAR2具有谷胱甘肽转移酶 (GST) 结构，包括2个结构域：由α螺旋和β折叠组成类硫氧还原蛋白结构域 (N末端结构域)以及由多个α螺旋组成的C末端结构域，2个结构域由10个氨基酸组成的linker相连接。2个蛋白的N末端结构域氨基酸大约组成了蛋白全长的1/3，包括 1 个 β-α-β-α-β-β-α 结构域。C 末端结构域占整个蛋白质的 2/3，SmDHAR1由 6个 α螺旋组成，而SmDHAR2比SmDHAR1在C末端多1个α螺旋 (图4A黑色箭头处)。

2.5 江南卷柏DHAR蛋白的生化特性分析

将构建的表达载体 pET30a/SmDHAR1和pET30a/SmDHAR2分别转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经 IPTG诱导后发现 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白能在大肠杆菌 BL21中进行可溶性表达 (图 5)。通过镍柱亲和层析纯化后，获得纯化的重组蛋白 (图5)，SDS-PAGE结果显示蛋白分子量与预测的SmDHAR1和SmDHAR2蛋白大小一致。

图4 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白三维结构的比较Fig. 4 Structure modelling of SmDHAR1 and SmDHAR2. (A)Structural comparison of SmDHAR1 (green) and SmDHAR2(red), N: N-terminus; C: C-terminus. (B) Evaluation of the structure of SmDHAR1 and SmDHAR2 by Profile-3D program.

图5 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白在大肠杆菌BL21中的表达和纯化Fig. 5 Overexpression and purification of recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2. 1: protein marker; 2 and 6: total cellular extracts from induced bacteria containing recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2, respectively; 3 and 7: supernatant after ultrasonication and centrifugation of cells expressing recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2, respectively; 4 and 8:cell pellet after ultrasonication and centrifugation of cells expressing recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2,respectively; 5 and 9: the purified recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2, respectively.

DHAR是植物GST基因家族的成员，由于植物GST对多种底物如 CDNB、NDB-Cl、DHA等具有广泛的活性[15]，所以我们分别测定了SmDHAR1和SmDHAR2蛋白对DHA、NBD-CI和CDNB三种底物的活性，结果表明，SmDHAR1和SmDHAR2对NBD-Cl和CDNB没有活性，但是对DHA具有催化活性 (图6)，说明江南卷柏DHAR蛋白具有脱氢抗坏血酸还原酶活性。对 DHA的催化活性测定参照Edwards等[14]的方法，纯化的SmDHAR1和SmDHAR2蛋白浓度分别是0.039 mg/mL和0.655 mg/mL，反应3 min后A265值分别是0.539和0.078 (图6)，经计算后 SmDHAR1和 SmDHAR2的活性分别为19.76 µmol/(min·mg) 和 0.17 µmol/(min·mg)，SmDHAR1的酶活性是SmDHAR2的116倍，说明SmDHAR1和SmDHAR2对DHA的活性有巨大的分化。

图6 SmDHAR1和SmDHAR2的酶活性分析Fig. 6 Activity analysis of recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2.

图7 SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的热力学稳定性Fig. 7 Thermal stability of recombinant SmDHAR1 and SmDHAR2.

SmDHAR1和SmDHAR2蛋白热力学稳定性结果如图7所示。结果显示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的热力学稳定性具有较大差异。SmDHAR1在50 ℃时还保持着最高活性的 80%，这预示着SmDHAR1蛋白在 50 ℃以下都是稳定的，表明SmDHAR1是一个热稳定的酶，可能在适应高温环境中发挥重要作用。而SmDHAR2在50 ℃时只剩50%的活性，活性随着温度的升高一直下降，预示着SmDHAR2蛋白热稳定性较低。

3 讨论

抗坏血酸还原酶广泛存在于植物的叶绿体、线粒体和细胞质中，对于保持植物细胞中AsA水平具有重要意义，而且广泛地参与植物的抗逆反应。蕨类植物约有 1.2万多种，在植物系统中介于苔藓植物和种子植物之间，分布广泛，除沙漠外世界各地都有生长[16]。在植物漫长的演化过程中，蕨类植物是最早脱离水体束缚、最早适应陆地生态环境和最早出现维管组织的类群[17]，因此在蕨类植物中研究与适应性密切相关的DHAR基因对于理解植物的适应性有重要的理论意义。在本研究中，我们从江南卷柏中克隆到2个DHAR基因，对该基因的基因结构、表达模式、所编码蛋白的结构与生化功能进行了比较详细的研究。

在我们先前的研究中发现DHAR基因在裸子植物白皮松和双子叶植物杨树中均是组成型表达基因[8,18]。最近对小麦2个DHAR基因 (TaDHAR1和TaDHAR1) 的研究发现，这2个DHAR基因在小麦的各个器官中均有表达，且表现出相似的表达模式，均表现为在幼穗中转录本水平最高，在根和小花中的转录本水平相对较低[7]。在本研究中，利用RT-PCR并结合PCR产品测序，我们发现SmDHAR1和 SmDHAR2基因在江南卷柏所有组织中均表达(图3)。因此这一系列研究结果预示着在蕨类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物中DHAR基因可能均是组成型表达基因，在植物的生长发育中可能发挥着重要作用。

通过蛋白质的序列比对，我们发现所有 DHAR蛋白都具有CPFS的保守基序 (Motif) (图8A)。大量研究证明CXXS基序在氧化还原酶中高度保守，在催化反应中作为酶的催化反应中心，CXXS基序中的第一个半胱氨酸与底物的半胱氨酸形成分子间共价二硫键[19]。江南卷柏SmDHAR1和SmDHAR2蛋白均含有CPFS的保守基序，位于蛋白N末端结构域的第一个 α螺旋的起始处 (图 4A中的蓝色箭头处)。对比SmDHAR1和SmDHAR2蛋白的三维结构，发现SmDHAR1蛋白的CPFS保守基序中，Ser侧链上的羟基与Pro主链上的羰基形成氢键 (图8B)，而SmDHAR2没有形成这个氢键，预示着 SmDHAR1和 SmDHAR2的活性中心的构象可能有较大的差异，这种构象的差异可能对酶的催化活性有重要影响，事实上，SmDHAR1的催化活性是 SmDHAR2的116倍，因此，酶学活性的结果也支持这2个酶的催化中心构象可能有较大差异。

图8 DHAR蛋白CPFS保守基序的序列与结构比较Fig. 8 Sequence and structural comparison of CPFS motif in DHAR proteins. (A) N-terminal amino acid sequence alignment of DHAR protein, CPFS motif was marked in red. (B) Structural comparison of CPFS motif between SmDHAR1 and SmDHAR2, Blue dashed represent hydrogen bond.

谷胱甘肽转移酶 (GST) 基因家族被分为 8个亚家族，分别是 DHAR、Tau、Phi、Zeta、Theta、Lambda、TCHQD 和 EF1Bγ[18]。植物 Tau、Phi和Zeta 类GST的晶体结构已被解析，结构显示所有植物GST的N末端结构域高度保守，而且主要负责和所有GST的共同底物谷胱甘肽 (GSH) 结合[15]。结构比较发现预测的SmDHAR2与SmDHAR1蛋白的N 末端结构域高度保守 (图 4A)，都具有β-α-β-α-β-β-α 结构，预示着这 2 个蛋白都能与 GSH结合，实验结果显示这2个蛋白都具有依赖GSH的DHA活性，因此酶学结果支持预测的三维结构。

结构比较发现植物GST的C末端结构域变异较大，这与GST的功能相关，因为植物GST的C末端结构域主要负责结合特异性底物[18]，不同的GST能结合特定底物而发挥不同的生理功能。在本研究中，SmDHAR2与SmDHAR1蛋白的C末端结构域差异较大，SmDHAR2比SmDHAR1在C末端多1个 α螺旋 (图 4A黑色箭头处)，而且在蛋白的第 4个与第5个α螺旋之间的Loop结构变化较大 (图4A红色箭头处)，这种C末端结构的变化预示着这2个DHAR的功能可能不同。事实上，SmDHAR1具有较高的催化活性 (19.76 µmol/(min·mg))，而 SmDHAR2的催化活性非常低 (0.14 µmol/(min·mg))，另一方面，热力学稳定性分析显示SmDHAR1比SmDHAR2蛋白更稳定，这些生化实验结果也预示着这2个蛋白可能存在功能上的分化。

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Molecular characterizations of two dehydroascorbate reductases from Selaginella moellendorffii

Zishuo Cheng1,3, Ting Lan1,3, Di Li2, Hailing Yang2, and Qingyin Zeng1
1 State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
2 College of Life Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
3 Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Received: February 26, 2010; Accepted: May 4, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2009AA06Z311), National Natural Science Foundation of China (No. 30770039), National Key Technology R&D Program (No. 2008BADC4B05).

Corresponding author: Ping Zheng. Tel/Fax: +86-571-86971709; E-mail: pzheng@zju.edu.cn

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2009AA06Z311)，国家自然科学基金 (No. 30770039)，国家科技支撑计划 (No. 2008BADC4B05) 资助。