含乙型肝炎病毒S-PreS1基因的DNA疫苗与蛋白颗粒疫苗联合免疫可增强免疫应答

陈红，邓瑶，谭文杰，王文，管洁，文波，殷霄，阮力

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒病应急技术中心，北京 100052

含乙型肝炎病毒S-PreS1基因的DNA疫苗与蛋白颗粒疫苗联合免疫可增强免疫应答

陈红*，邓瑶*，谭文杰，王文，管洁，文波，殷霄，阮力

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒病应急技术中心，北京 100052

为研制新型有效的HBV治疗性疫苗，构建了含PreS1与S融合基因的HBV DNA疫苗，即pVRC-HBSS1 (PreS1 21–47 aa融合在S抗原1–223 aa的羧基端)，并制备了CHO表达相同结构的蛋白颗粒亚单位疫苗HBSS1。在Balb/C小鼠中采用不同的DNA免疫方式 (即肌肉注射、皮内注射加电转) 初免3次，蛋白颗粒亚单位疫苗 (不同佐剂) 肌肉注射加强免疫 1次，然后我们分析比较了各组疫苗所引起的免疫应答特点。抗体检测结果表明：皮内注射结合电转初免组产生的PreS1与S特异性抗体水平皆高于肌肉直接注射组。进一步还发现DNA疫苗与蛋白颗粒亚单位疫苗两种疫苗联合应用后S抗原特异的细胞免疫应答 (IFN-γ ELISpot分析) 明显高于DNA疫苗或蛋白颗粒亚单位单独应用，其中皮内注射+电转结合蛋白颗粒亚单位疫苗联合免疫组可产生最强的细胞免疫应答。这些研究为新型HBV治疗性疫苗的优化设计与合理应用提供了依据。

乙型肝炎病毒 (HBV)，DNA疫苗，颗粒亚单位疫苗，电转，联合免疫

Abstract:To develop novel and effective HBV therapeutic vaccine, we constructed an expression vector, pVRC-HBSS1, in which PreS1 (21−47aa) coding gene fused to the C-terminal of the S (1−223 aa) coding gene of HBV, and prepared the protein particle vaccine HBSS1 that consist of S and PreS1 fusion antigen derived from CHO system. We immunized mice by priming three times with DNA vaccine via different methods (i.e., intramuscular injection, intradermal injection with electroporation), then boosting oncewith protein particle vaccine. We analyzed the immune response among various vaccination groups. The higher level of S or PreS1 specific antibodies was detected in the group via intradermal injection with electroporation, compared with that of direct intramuscular injection. We further found that the specific cellular immune responses (IFN-γ ELISpot analysis) in the group priming with DNA vaccines and boosting with protein subunit vaccine particles, was significantly higher than that of the DNA or protein particle subunit alone. Moreover, combination vaccination priming with intradermal injection DNA via electroporation and boosting with protein particle induced the strongest cellular immune response. These results provide a basis for rational design and application of the novel HBV therapeutic vaccine.

Keywords:Hepatitis B virus (HBV), DNA vaccine, subunit particle vaccine, electroporation, prime boost vaccination

乙型肝炎病毒 (HBV) 不仅可引起急慢性肝炎，而且与肝硬化、肝癌的发生密切相关，尽管乙肝疫苗的使用已逾20年，目前HBV仍是传播最为广泛的病原之一[1]。HBV疫苗在中国已纳入计划免疫，使用最为广泛的为酵母或CHO表达含S全长的颗粒亚单位疫苗[2]。尽管 HBV疫苗的应用已达 20余年并取得极大成功，但仍有5%~10%的人群不能产生保护性anti-HBS抗体，且近年来，S变异流行株呈增长趋势[2]。目前全球绝大多数慢性HBV感染者得不到有效治疗，而长期持续性感染将可能最终导致肝硬化、肝衰竭或者肝癌，当前临床上乙肝主要药物的治疗效果有限，且长期应用中存在不良反应，仍需开发新的治疗策略，因而HBV治疗性疫苗的研发与应用成为近年来研究的热点。

HBV的治疗性疫苗主要包括重组蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗等[2]，DNA疫苗与蛋白疫苗相比，除了可激发特异性抗体应答外，还可产生较强的、持久的T辅助 (Th) 细胞应答与抗原特异的CTL反应。此外，DNA疫苗还具备制备简单、低廉并易于多价使用等优点[3]，多种DNA疫苗应用的结果表明其主要的问题是其免疫原性相对较弱 (尤其是在大动物与人中)，故近年来科学家们探索了采用多种途径增强其免疫原性[3]，如抗原改造、与蛋白疫苗或载体疫苗联合应用、采用基因枪及体内电转等方式免疫等。

本研究在前期工作基础上[4-5]首先构建了含PreS1与S融合抗原的HBV DNA疫苗[6]，即pVRCHBSS1 (PreS1与S融合)，分别采用肌肉注射、皮内注射+电转两种方式初免后，用蛋白颗粒亚单位疫苗(不同佐剂) 肌肉注射加强免疫1次，在小鼠中比较分析了体液与细胞免疫应答特点。

1 材料与方法

1.1 HBV颗粒蛋白疫苗与佐剂

CHO表达的含 S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗(HBSS1) 的制备及表达鉴定 (SDS聚丙烯胺凝胶电泳及电镜观察) 参见文献[4]。Al(OH)3佐剂为北京华尔盾科技服务公司提供，浓度为2 mg/mL；CpG-ODN 1826[4-6]由NEB 公司合成，由上述抗原与佐剂分别配伍成2种免疫制剂，即HBSS1+Al(OH)3、HBSS1+CpG，其中每剂中抗原含量皆为 2 μg，Al(OH)3含量为 1 mg/mL，CpG 含量为 10 μg。

1.2 HBV DNA疫苗的构建与表达鉴定

包含 HBV S抗原 (S:1–223 aa) 与前 S1抗原(PreS1：21–47 aa) 融合基因的pcHBSS表达质粒为本室保存[9]，可用于在 CHO细胞中表达制备 HBV颗粒样蛋白疫苗。乙肝病毒颗粒样 DNA疫苗质粒pVRC-HBSS1的构建参见文献[6]，即将HBV S抗原 (S:1–223 aa) 与前 S1 抗原 (PreS1：21–47 aa) 融合基因的目的片段，连接到pVRC8301载体上，限制酶分析和测序筛选获得HBV DNA疫苗阳性质粒pVRC-HBSS1。DNA疫苗质粒用 Endofree试剂盒(德国 Qiagen) 纯化。纯化的 pVRC-HBSS1质粒DNA瞬时转染293T细胞，转染48 h后裂解293T细胞，取样进行SDS-PAGE电泳，转膜进行Western blotting分析，用抗PreS1小鼠单抗作为一抗检测靶抗原表达 (图1)。

图1 乙肝病毒新型DNA疫苗的表达检测及颗粒亚单位蛋白疫苗的鉴定Fig. 1 Expression detection of HBV DNA vaccine containing PreS1 and S fusion gene. (A) Western blotting analysis of expression of SS1 antigen in the HBV DNA vaccine. (B)Characterization of HBV particle subunit vaccine which consist of SS1 antigen by SDS-PAGE staining. (C) Electronmicrograph of HBV particle subunit vaccine which consist of SS1 antigen. M: protein marker; SS1: S+PreS1 fusion antigen;S: S antigen.

1.3 动物分组与免疫方案

Balb/C小鼠，雌性，6~8周龄，购自中国医学科学院动物实验繁殖中心，按照免疫方式随机分为4组 (表1)，A、B与C每组12只，另设生理盐水对照组 (6只)，注射方式和免疫剂量见表1。DNA 疫苗初免 (0、3、6周)，A组和 B组为肌肉注射，C组为皮内注射，结合卡钳式电转免疫 (表1)[7-8]，采用BTX ECM830电穿孔仪，卡钳式电极皮内免疫 (C组) 的电转参数为：100 V，10 ms间隔，3次脉冲；然后电极反向，75 V，15 ms，3次脉冲，间隔1 s/次。蛋白加强 (第 10周) 为肌肉注射免疫。A、B与 C每组分别于第10周与第14周各取6只采血与脾细胞进行抗体检测与细胞免疫应答分析。

1.4 体液免疫应答检测

眼眶采血检测抗体，倍比稀释后，参照试剂盒说明进行[5-6]。每组血清混合后皆从1∶10起倍比稀释。

1.5 IFN-γ ELISpot检测

HBV S抗原合成肽库参见文献[5]，分别与小鼠脾细胞 (5×105) 孵育，具体操作按试剂盒说明书进行[5-6]。反应终止后在ELISpot 读数仪上计数分析，以106脾细胞中斑点 (减去无关肽孔) 计数求均值。实验数据采用SPSS14.0软件处理，统计学分析采用One-way ANOVA 检验法。

表1 动物分组及免疫方案Table 1 Group and immunization of mice used in this study

2 结果

2.1 DNA疫苗的表达及颗粒亚单位蛋白疫苗的检定

本实验以前的研究表明[4]，将 HBV PreS1区21-47位氨基酸融合到截短型S抗原 (1−223 aa) 的羧基端，可在CHO系统中表达形成稳定的VLP结构抗原，为此本研究中将上述含 PreS1的融合抗原克隆到DNA疫苗载体pVRC上形成DNA侯选疫苗，即 pVRC-HBSS1，体外瞬时转染 293T细胞后进行Western blotting分析证实融合抗原的有效表达 (图1A)。因糖基化不同，SS1出现大小约为24、27 kDa两条带。颗粒亚单位蛋白疫苗的SDS-PAGE电泳及颗粒的电镜鉴定参见文献[4] (图1B，1C)。Western blotting与SDS-PAGE染色实验中采用仅含S主蛋白的DNA疫苗或颗粒亚单位蛋白作对照。这些结果均与前述文献报道相符。

2.2 DNA疫苗初免颗粒样蛋白疫苗加强后小鼠的抗体应答及IgG亚型

DNA疫苗初免后4周，肌肉注射组抗PreS1及抗S抗体平均滴度分别为60与10，而皮内注射结合电转组则分别为200与1 000；蛋白疫苗加强免疫后4周采血进行特异性抗体滴度的测定，结果表明(表2)：与初免后4周测定结果相比，抗体平均滴度各组皆有所提高，其中抗PreS1抗体以A组 (肌肉注射 DNA疫苗初免，蛋白疫苗结合 Al(OH)3佐剂加强免疫) 抗体平均滴度最高，而抗S抗体以C组(DNA疫苗皮内注射+电转初免，蛋白疫苗结合Al(OH)3佐剂加强免疫) 平均滴度较高，蛋白疫苗结合CpG 佐剂加强免疫组 (B组) S与PreS1抗体平均滴度皆低于蛋白疫苗结合Al(OH)3佐剂加强免疫组 (A和C组)。除了对抗体滴度进行分析外，我们也在末次免疫后第4周采血以1∶100稀释后对各组诱导的IgG亚型进行分析 (表2)，结果表明：DNA疫苗肌肉注射或皮内注射结合电转初免，含铝佐剂的蛋白制剂加强后 (A和 C组) 产生的针对 S与PreS1的抗体 IgG亚型各组 IgG2a /IgG1＞1；而含CpG佐剂的蛋白制剂加强后 (B 组) 抗 PreS1抗体以IgG2a为主，而针对S的抗体IgG亚型，则IgG1略高于IgG2a。

表2 联合免疫后抗原特异的总抗体平均滴度与亚型Table 2 Total antibody titers and subtype class in sera of mice after prime-boost vaccination

2.3 DNA疫苗初免颗粒样蛋白疫苗加强后小鼠的抗原特异性细胞免疫应答明显增强

作为治疗性DNA疫苗，细胞免疫应答是评定有效性最关键的评价指标，为此我们采用 IFN-γ ELISpot方法检测了DNA疫苗初免后4周及 DNA疫苗与蛋白疫苗联合免疫后 4周各组小鼠脾细胞中抗原特异的IFN-γ分泌细胞数，结果如图2所示。DNA疫苗初免蛋白疫苗加强应用后 S特异的 SFC读数明显提高，SFC读数均值＞400 SFC/106脾细胞，显著高于DNA疫苗肌肉注射初免各组。而且以DNA疫苗皮内电转初免 (10 µg)，结合蛋白制剂加强应用后增强效果最明显 (SFC读数均值＞800 SFC/106脾细胞)。

图2 ELISPOT分析不同HBV疫苗免疫后小鼠脾细胞中IFN-γ分泌斑点形成细胞数 (SFCs)Fig. 2 ELISPOT analysis for IFN-γ secretion in mouse splenocytes immunized with different HBV vaccines as indicated. Data represent the average of spot forming cells(SFCs) per million of splenocytes from 6 mice/group. * P<0.05;** P<0.01.

3 讨论

诱导针对多个抗原的较强的体液与细胞免疫应答是研制新型 HBV治疗性疫苗的目标[2,11-12]。HBV 表面抗原 (HBS) 在 CHO细胞或酵母中表达可自我装配成22 nm球形VLP，是市售HBV疫苗的有效保护性抗原[2]。PreS1含多个比S蛋白免疫原性更强的 T细胞和 B细胞表位[9-10]，并含肝细胞结合位点 (21−47 aa)，对于病毒的附着与进入等有重要作用[13]，故对PreS1抗原的免疫反应在中和和阻断HBV感染及清除HBV感染上起着重要作用[9-12]。

前期的实验结果表明[4]：在 CHO细胞中表达HBSS1 即 S (1−223 aa)+PreS1 (21−47 aa) 亦可形成稳定分泌的病毒样颗粒，PreS1与S抗原的摩尔比率为1∶1。这种病毒颗粒样蛋白抗原皆可在动物模型中快速激发有效的体液免疫应答[4-5]。而 DNA疫苗制备快速、低廉，而且较蛋白疫苗更易激发较强的细胞免疫应答，但目前DNA疫苗面临的主要挑战是免疫强度有待增强[3,11]。最近大量文献报道[3,7-8,11]通过体内电转可明显增强细胞对外源 DNA的摄取与表达水平，外源蛋白引起局部的炎性因子聚集从而可同时提高DNA疫苗所诱导的体液与细胞免疫应答水平，而DNA疫苗与蛋白疫苗或载体疫苗联合应用则是增强 DNA疫苗免疫应答最有效的策略之一[3]。

本研究旨在研制可诱导多抗原特异细胞免疫应答的HBV治疗性疫苗，故首先采用DNA疫苗载体构建了包含上述颗粒样结构的 DNA疫苗，即pVRC-HBSS1，为增强免疫原性，结合应用电转方式进行初免；同时为进一步增强免疫应答水平，采用了与蛋白颗粒亚单位疫苗联合应用的免疫策略，在小鼠中分析比较其免疫应答特点。

我们的前期研究采用 2次蛋白疫苗 (含不同佐剂) 肌肉注射初免，1次DNA疫苗皮内电转免疫加强的联合免疫方式，在小鼠中分析比较了各疫苗所引起的体液与细胞免疫应答。结果表明[6]：HBSS1 DNA疫苗结合皮内注射+电转方式可明显加强含S-PreS1颗粒的蛋白疫苗在小鼠中免疫效果，其特异性抗体滴度皆高于104，高于本研究中采用的联合免疫所诱导的抗体水平，但细胞免疫强度却明显低于本研究中采用的联合免疫，前者小鼠中 IFN-γ分泌斑点形成细胞数均值皆低于250 SFC/106脾细胞，而本研究中联合免疫后SFCs读值均高于400 SFC/106脾细胞，最高均值达800 SFC/106脾细胞。故本研究中所采用的联合免疫方案更适合 HBV治疗性疫苗的要求。

总之，本研究中HBSS1 DNA疫苗初免蛋白疫苗加强的联合免疫策略，结合皮内电转方式可产生最强的抗原特异的细胞免疫应答，是研发新型有效HBV治疗性疫苗的侯选制剂与免疫方案，值得进一步在大动物或人群中评价与应用。

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Boosting with HBV subunit particle vaccine enhance immune response of novel DNA vaccine consisting of S-PreS1 fusion gene in mice

Hong Chen*, Yao Deng*, Wenjie Tan, Wen Wang, Jie Guan, Bo Wen, Xiao Yin, and Li Ruan
Biotech Center for Viral Diseases Emergency, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China

Received: April 7, 2010; Accepted: June 7, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 30770146, 30770149), National Basic Research Program of China (973 Program)(No. 2009CB119104).

Corresponding author: Qingyin Zeng. Tel: +86-10-62836440; E-mail: qingyin.zeng@ibcas.ac.cn

国家自然科学基金 (Nos. 30770146, 30770149)，国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2009CB119104) 资助。