3，5－二硝基水杨酸法测定金钱草多糖的研究

林志銮，刘俊劭

(武夷学院环境与建筑工程系福建省高校绿色化工技术重点实验室，福建武夷山354300)

3，5－二硝基水杨酸法测定金钱草多糖的研究

林志銮，刘俊劭

(武夷学院环境与建筑工程系福建省高校绿色化工技术重点实验室，福建武夷山354300)

用溶剂法对金钱草多糖进行提取分离，研究并确定了用3，5－二硝基水杨酸(DNS)比色法测定金钱草多糖含量的方法，测定条件为:DNS最佳用量为2.0 mL，最佳显色时间为5.0 min，最优的温度为沸水加热.对金钱草多糖样品平行测定6次，相对标准偏差(RSD)为3.98%.样品加标回收率在92.52% ～104.49%之间，检出限为0.022 mg/mL.

金钱草;3，5－二硝基水杨酸;多糖

金钱草为报春花科植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的新鲜或干燥全草，又名大金钱草、对座草、路边黄、遍地黄等，被中国药典2000年版所收载［1－2］.近年来有关金钱草的化学成分已有报道，主要含有酚类、黄酮类、甙类、鞣质、挥发油等［3－4］，但目前针对金钱草多糖的分析研究还不多见.

天然多糖来源于动物、植物及微生物，在海藻、真菌和高等植物中最为丰富.近年来对植物多糖的研究报道日趋增多，并发现很多多糖具有多种生物活性［5－6］.植物中糖类的测定主要采用分光光度法和色谱法进行测定［7－8］.分光光度法因为投入费用低、操作简单而容易普及，其中水杨酸法比苯酚－硫酸法［9－10］又具有毒性低、腐蚀性小、安全性好等特点.文中利用溶剂法提取分离金钱草中多糖，研究了3，5－二硝基水杨酸法测定金钱草多糖含量的方法［11］.

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

紫外可见分光光度计UV－2550(日本岛津)，真空干燥箱(上海精宏)，自动纯水蒸馏器(上海嘉鹏科技有限公司)，微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器厂).

DNS显色试剂的配制:准确称取无水的3，5－二硝基水杨酸6.5 g，氢氧化钠3.2 g溶解于40 mL蒸馏水中，加入15 mL丙三醇溶解定容至1 000 mL，贮存于棕色试剂瓶中［12］.

葡萄糖标准溶液的配制:精确称取在105℃ 烘干至恒重的葡萄糖0.100 0 g，定容到50 mL，即为2.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液，其余药品及试剂均为分析纯.金钱草来自武夷山地区，经武夷学院绿色化工技术重点实验室贾剑晖实验师鉴定，自然晒干后，烘至恒重备用.

1.2 实验方法

1.2.1 金钱草多糖的提取

金钱草全株→粉碎→石油醚回流2 h→乙醇回流2 h→蒸馏水煎1.5 h，重复3次合并水煎液浓缩到50 ml→乙醇沉淀→复溶→sevage法脱蛋白→乙醇沉淀→减压过滤→丙酮溶剂洗涤→干燥→金钱草粗多糖.

1.2.2 多糖测定的方法

用3，5－二硝基水杨酸法测定金钱草多糖的含量.准确移取葡萄糖溶液标准0.5 mL于25 mL比色管中，补充0.5 mL蒸馏水，再准确加入2.0 mL的DNS溶液，沸水浴5 min，快速冷却到室温后，定容到25 mL.用紫外可见分光光度计在530 nm测定.

2 结果与讨论

2.1 影响因素的研究

2.1.1 最大吸收波长的确定

空白溶液调零后，对上述葡萄糖、总糖样品进行200～800 nm扫描，经比较分析结果后，取干扰较少、测定稳定且灵敏度较高的530 nm作为测定波长.

2.1.2 DNS用量的确定

准确移取葡萄糖标准溶液0.5 mL于25 mL比色管中，分别补水0.5 mL蒸馏水，再准确加入1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 mL 的 DNS溶液，沸水浴 5 min，快速冷却到室温后，定容到25 mL，测定.由图1看出，DNS用量为2.0 mL时吸光度达到最大，为此选择2.0mL为最佳DNS用量.

2.1.3 DNS显色时间的确定

准确移取葡萄糖标准溶液0.5 mL于25 mL比色管中，分别补加0.5 mL蒸馏水，再准确加入2.0 mL的 DNS 溶液，沸水浴1，2，3，4，5，6，7，8 min，快速冷却到室温后，定容到25 mL，测定.从图2可知，显色时间小于3 min时，反应不完全，3～5 min内吸光度缓慢上升，5 min后，吸光度基本无变化，为此，我们选用沸水浴5 min作为显色时间.

2.1.4 比色反应温度对显色的影响

按照1.2.2方法制备样品，分别加热至60，70，80，90，100℃，快速冷却到室温后，定容到25 mL后测定.由图3中可以看出，吸光度随着温度的升高而升高，90℃以后吸光度增加的趋势减小，为此选择沸水浴为比色温度.

2.1.5 工作曲线的确定

准确移取葡萄糖标准溶液 0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于25 mL比色管中，分别补充1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.0 mL 蒸馏水，再准确加入2.0 mL 的DNS溶液，沸水浴5 min，快速冷却到室温后，定容到25 mL，测定.工作曲线为:Y=2.167 7 X－0.000 8，r=0.996 9，结果表明该方法具有良好线性关系.

2.1.6 精密度、回收率的确定

准确移取样品0.5 mL多糖样品溶液，按照1.2.2方法平行测定6次，RSD=3.98%.

精确移取0.5 mL金钱草样品，再加入0.25 mL葡萄糖标准溶液按照1.2.2方法测定，样品加标回收率(见表1)在92.52% ～104.49%之间.

表1 3，5－二硝基水杨酸法方法加标回收率

2.1.7 方法检出限的确定

对0.2，0.4，0.6 mg/mL葡萄糖标准溶液分别进行6次重复测定(结果见表2)，求出每个浓度的标准偏差S1，S2，S3，并对3个标准偏差和浓度进行线性回归分析，得回归方程.当x=0时，求得S0=0.007 4，3倍的S0即为该方法的最小检测限.

表2 3，5－二硝基水杨酸法方法检出限

2.2 样品测定

精确称取提取的金钱草多糖样品0.050 0 g，加水定容到10 mL容量瓶中.准确移取该试液0.5 mL于25 mL比色管中，按照1.2.2方法制备样品，平行测定3次(结果见表3).

表3 金钱草多糖提取物含量

3 结语

建立了用3，5－二硝基水杨酸(DNS)比色法测定金钱草多糖的方法，RSD为3.98%，样品加标回收率为95.52% ～104.49%.该方法显色稳定、操作简单、低毒和安全性好等特点.本实验方法简便易行，实用有效，快捷.具有投入费用低、操作简单，容易普及、毒性低、腐蚀性小，安全性好等特点.

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［12］王红梅，鲍大鹏，杨立民.柱状田头菇胞内外多糖的提取和测定［J］.安徽农业技术师范学院学报，2000，14(3):18－20.

(责任编辑戴 云)

Determination of the Factors Affecting the Content of Polysaccharide in Lysimachia Christinae Hance by 3，5 －Dinitrosalicylic Acid Colorimeter

LIN Zhi-luan，LIU Jun-shao
(Key Laboratory for Green Chemical in Chemical Engineering and Technology Specialty of Fujian
Higher Education，Department of Civil Engineering and Architecture，Wuyi university，Wuyishan 354300，China)

The solvent extraction separation of Lysimachia christinae Hance′s polysaccharide was studied.The content of polysaccharide was determined by 3，5 －dinitrosalicylic acid(DNS)colorimeter.The DNS optimum dosage was 2.0 mg/mL，the best time for colorimeter was 5.0 min，and the optimal temperature was 100℃.The sixtime parallel determination proved to be RSD=3.98%，the recovery rate was between 92.52%—104.49%，and the detection limit of glucose was 0.022 mg/mL.

Lysimachia christinae Hance;3，5 －dinitrosalicylic acid;polysaccharide

O 629.12

A

1672－8513(2011)02－0089－03

10.3969/j.issn.1672－8513.2011.02.003

2010－09－29.

武夷学院科学研究基金(XQL05022).

林志銮(1981－)，男，硕士，助理实验师.主要研究方向:有机分析.