匀浆法提取－高效液相色谱法测定金银花中的绿原酸

薛景娇，和顺琴，杨光宇，胡秋芬

(云南民族大学化学与生物技术学院民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650500)

匀浆法提取－高效液相色谱法测定金银花中的绿原酸

薛景娇，和顺琴，杨光宇，胡秋芬

(云南民族大学化学与生物技术学院民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650500)

分别用3种前处理方法对金银花中的绿原酸进行提取，用高效液相色谱法进行检测.结果表明，用匀浆法提取所需时间明显少于热回流提取法和超声波提取法，采用80%的甲醇匀浆法提取金银花中的绿原酸，提取液中的绿原酸以Waters Xterra RP18(3.9 mm×150 mm，5 μm)色谱柱为固定相，1%醋酸为流动相，梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，检测波长345 nm.在该色谱条件下，绿原酸质量浓度在5.0～200 μg/mL内成良好的线性关系，样品平均加标回收率为118%，相对标准偏差(RSD)为4.5%(n=6)，结果令人满意.

金银花;绿原酸;匀浆法提取;高效液相色谱法

金银花(Flos Lonicerae)为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thumb)、红腺忍冬(Lonicera hypoinlauca Miq)、山银花 (Lonicera confusa DC)或毛花柱忍冬(Lonicera dasystyla Rehd)的干燥花蕾或带初开的花，可供药用的品种达40余种，广泛分布于全国各地［1］.金银花忍冬花蕾中含有木犀草素、肌醇、绿原酸、异绿原酸、皂贰等.其中绿原酸和异绿原酸为主要抗菌成分［2］，绿原酸被称为“植物黄金”.目前《中国药典》(2005版一部)以金银花中所含绿原酸的含量作为评价本药材质量标准的指标之一，它是一种由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，为抗菌消炎的主要成分，与人体血小板凝集和凝血因子的生成有关，还具有抗生育作用及对免疫系统的调节作用［3－4］.

金银花中绿原酸的传统提取方法有水提法、乙醇回流法、酶解法、动态温浸法、超声波提取法、渗漉法、超滤法和离子液体微波辅助萃取法［5－10］.绿原酸含量检测测定方法的研究报道很多，主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、蒸发光散射检测法和流动注射化学发光法［11－15］.其中，高效液相色谱法是最常用的方法.文中研究了匀浆、超声波提取及热回流3种不同的前处理方法，建立了一种高效液相色谱法(HPLC)测定匀浆法提取金银花中绿原酸的方法.本方法操作简便，具有快速、灵敏、准确等特点.

1 材料与方法

1.1 仪器及材料

Agilent1100高效液相色谱仪(包括二元泵，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱，Chemstation色谱工作站);IKA T25型高速匀浆机，Elma D－78224型超声仪.绿原酸对照品(购于瑞士Fluka公司)，使用时用80%甲醇配成200 μg/mL的标准储备液，所需标准工作液由该储备液稀释得到，甲醇、乙醇、醋酸为分析纯，所用水为高纯水.样品为粉碎后过0.441 mm筛孔的金银花.

1.2 色谱条件

色谱柱:Waters XTerra RP 18(3.9mm ×150 mm，5μm);流动相(A:纯甲醇，B:1%醋酸);梯度洗脱条件(0～6 min:100% ～70%;6～12 min:70% ～20%;12～15 min:20%;15～17 min:20%～100%);流速:0.8 mL/min;柱温:20℃;检测波长:345 nm.

1.3 样品前处理

1)80%甲醇匀浆提取.准确称取0.25 g样品，加入50 mL 80%甲醇水溶液，在IKA T25型高速匀浆机20 000 r/min的条件下，进行2.0 min匀浆提取，取5.0 mL的提取液用0.25 μm针头过滤器过滤，进样 10.0 μL 进行分析;

2)热回流提取.准确称取0.25 g样品，加入50 mL 80%甲醇水溶液，在50℃的条件下，进行40 min回流提取，取5.0 mL 的提取液用0.25 μm 针头过滤器过滤，进样10.0 μL 进行分析;

3)超声波提取.准确称取0.25 g样品，加入50 mL 80%甲醇水溶液，用Elma D－78224型超声仪，进行30 min超声提取，取5.0 mL的提取液用0.25 μm 针头过滤器过滤，进样 10.0 μL 进行分析;

4)80%乙醇匀浆提取.准确称取0.25 g样品，加入50 mL 80%乙醇水溶液，在IKA T25型高速匀浆机20 000 r/min 的条件下，进行 2.0 min ，取 5.0 mL的提取液用 0.25 μm针头过滤器过滤，进样10.0 μL 进行分析;

5)高纯水匀浆提取.准确称取0.25 g样品，加入50 mL高纯水，在IKA T25型高速匀浆机20 000 r/min的条件下，进行 2.0 min ，取 5.0 mL 的提取液用 0.25 μm 针头过滤器过滤，进样 10.0 μL 进行分析.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

绿原酸属于有机酸类物质，在HPLC测定时易发生前伸或拖尾峰，流动相加入酸可以改善这种现象.用1%的醋酸，进行梯度洗脱，可得到较好的色谱峰形［16］，因此本实验选择1%的醋酸为流动相.绿原酸在345 nm处有最大吸收，因此实验选择检测波长为345 nm.在上述条件下，标样和实际样品的色谱图见图1.

2.2 样品的制备

发现利用匀浆法提取绿原酸，绿原酸在3种提取液中的溶解度依次是:80%甲醇＞80%乙醇＞高纯水，因此本实验中采用80%的水－甲醇提取.分别用1.3中1)、2)和3)方法制备样品溶液，结果表明:把0.25 g样品中的绿原酸提出，超声波提取需要30 min，热回流提取需要40 min，而高速匀浆提取只需2.0 min，在该条件下，HPLC所测3种前处理方法的峰面积见表1.高速匀浆法效率明显高于热回流提取和超声波提取法;因此本实验选用高速匀浆法的前处理方法.

表1 3种前处理方法的峰面积

2.3 工作曲线

分别配制 200，100，50，10，5 μg/mL 的绿原酸标样，进样10 μL，测定不同质量浓度标准溶液峰面积，以绿原酸的质量浓度C(μg/mL)对峰面积(A)进行回归，结果表明，绿原酸在5.0～200 μg/mL和峰面积成良好的线性关系，回归方程为:

2.4 精密度试验

在上述色谱条件下，取金银花样品连续测定6次，计算6次结果的相对标准偏差，RSD=1.8%，表明进样方式和仪器精密度良好.

2.5 重现性试验

上述色谱条件下，精密称取同一批号的金银花样品6份，进样测得绿原酸峰面积，RSD=2.1% ，方法重现性好.

2.6 加样回收率试验

相同样品7份，其中1份为对照，另外6份分别加入100 μg/mL的绿原酸标样1 mL，在上述色谱条件下进行测定，样品平均加标回收率为118%，RSD=4.5%.

3 结语

本实验采用了匀浆法、超声波和热回流3种前处理方法对金银花中的绿原酸进行提取.实验对比结果表明，匀浆提取法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，所需时间明显少于热回流和超声波提取法，提取后可直接进样分析，样品前处理步骤简单，处理过程中目标物的损失少，方法回收率和精密度均很高.本方法适用于金银花中绿原酸含量的分析.

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(责任编辑王 琳)

Determination of Chlorogenic Acid Extracted from Flos Lonicerae with High－Speed Homogenization and High Performance Liquid Chromatography

XUE Jing-jiao，HE Shun-qin，YANG Guang-yu，HU Qiu-fen
(Key laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry，State Ethnic Affairs commission ＆ Ministry of Education，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China)

In this paper，three sample preparation for determination of chlorogenic acid in flos lonicerae was studied.Test results showed that the time spent on high － speed homogenization extraction was obviously less than the ultrasonic extraction and the hot reflux extraction.The chlorogenic acid was extracted from samples by high－speed homogenization with 80%methanol solution.The extract was separated on a Waters Xterra RP18 column(3.9mm×150 mm，5 μm)using 1%acetic acid as the mobile phase with gradient elution，the flow rate was 0.8 mL/min.The detection wavelength was 345 nm.Under this condition，the linear of chlorogenic acid was in the range of 5.0—200 μg/mL.The average recoveries of the samples were 118%，and the relative standard deviation was 4.5%(n=6).This method for the extraction and determination of chlorogenic acid in flos lonicerae has good results.

flos lonicerae;chlorogenic acid;high-speed homogenization;HPLC

O 658

A

1672－8513(2011)02－0086－03

10.3969/j.issn.1672 －8513.2011.02.002

2010－10－09.

国家自然科学基金(20961012);民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室开放基金(MJY090102).

薛景娇(1984－)，女，硕士研究生.主要研究方向:民族药质量评价.

胡秋芬(1973－)，女，博士，教授.主要研究方向:药物质量控制.