DY杆菌发酵工艺研究

马大中，郑白水，李 红，杨文峰，陈长俞

(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，辽宁 沈阳 110027)

DY杆菌发酵工艺研究

马大中，郑白水，李 红，杨文峰，陈长俞

(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，辽宁 沈阳 110027)

目的 提高生产代码为DY杆菌的发酵质量。方法 改进DY杆菌发酵工艺流程，由原来一级发酵改为二级发酵，并调整通气量为16 m3/h。结果 新工艺的DY杆菌发酵活性较原工艺提高了40%，物料消耗为原工艺的75%，发酵周期平均缩短了4 h，综合降低生产成本60%。结论 新工艺更适合于菌种的繁殖和芽孢的形成，值得应用和推广。

DY杆菌;发酵工艺;二级发酵;芽孢形成率

我公司生产的代码为DY的杆菌，属兼性厌氧菌，进入肠道后，可通过生物夺氧和生物拮抗作用，促进肠道益生菌的生长，抑制肠道致病菌的生长，从而调整肠道菌群失调，可用于某些肠道疾病的治疗[1－2]。DY杆菌的菌体通过液体深层培养、微生物发酵获得，自1998年生产以来，产品虽稳定性良好，但仍存在发酵周期各批次差异较大的问题。公司引进了自动化监控系统对产品进行升级改造，将各项发酵参数都设定在可监测范围内，这为发酵各项指标的优化提供了基础。为此，笔者对DY杆菌的发酵工艺进行了研究与改进，考察不同工艺条件下的发酵产量及活性，确立了更好的发酵工艺，效果较为理想，实现了降低成本、节降能耗、提高发酵质量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:代码为DY的芽孢杆菌。

培养基:肉汤培养基，以蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、牛肉膏0.5%、纯化水配制，调节 pH至中性;分离培养基，以蛋白胨1.0%、牛肉膏 0.5%、氯化钠 0.5% 、琼脂粉 1.6%、纯化水配制，调节pH至中性;发酵培养基以蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%、一级水配制，调节pH至中性。

1.2 方法

1.2.1 DY杆菌生产

斜面种子制备:将原始菌株接种入肉汤培养基，于(37±1)℃恒温培养若干小时进行活化，采用划线分离方法，培养形成单菌落。对其进行生化反应、菌体形态及菌落形态鉴定，进行斜面接种，制备工作种子批。将制备的斜面种子在2～8℃冰箱中保存，备用。

生产种子液制备:挑取斜面种子，接种到肉汤培养基中，在(37±1)℃恒温摇瓶柜上培养，制备成生产种子液。

发酵:按原工艺、新工艺流程对比试验的不同方案，将生产种子液分别接种到发酵罐中，于(37±1)℃发酵培养。

1.2.2 原菌粉制备

取离心后的发酵菌泥与辅料，按照一定比例混匀，低温烘干。取样，待检。

1.2.3 菌粉活性测定

按照平板菌落计数法测定菌粉活性。取发酵离心后制备好的原菌粉若干，加入含玻璃珠的无菌肉汤中，在摇床上振荡20 min，制备原菌液;取若干支试管，各装入适量肉汤，采用梯度稀释法，逐级稀释至10－7～10－8。分别取稀释后的菌液1 mL，置于平皿中，倒入溶解好的营养琼脂。待琼脂凝固后，倒置放入(37±1)℃恒温培养箱内培养。取出平板，计算菌落数。

1.2.4 两种工艺流程对比试验

原生产工艺(一级发酵，通气量20 m3/h)与新生产工艺(二级发酵，通气量16 m3/h)的流程图见图1及图2。按照生产工艺流程，考察发醇过程中培养基浓度、发酵周期及芽孢形成率等各参数，发酵结束后考察菌粉活性，同时兼顾生产成本(每罐)。

图1 DY杆菌原生产工艺流程

图2 DY杆菌新生产工艺流程

1.2.5 发酵时通气量影响试验

发酵时通气量的大小对DY杆菌的生长和芽孢的形成影响巨大。采用新工艺，选取不同的通气量(8，12，16，20，24 m3/h)来考察发酵的效果。

2 结果

2.1 生长曲线对比

结果见图3。

图3 生长曲线图

2.2 考察项目数据对比

表1 原工艺与新工艺考察项目数据对比(每罐)

结果见表1。可见，新工艺中投入的生产原料减少，发酵周期缩短，实罐灭菌时间减少，既节省了人力成本，又减轻了对培养基营养成分的破坏，使得发酵后期芽孢形成率有所提高，菌粉活性同时得以改善。

2.3 发醇时通气量影响试验

结果见表2。可见，通气量为16 m3/h时最有利于DY杆菌的生长。

表2 发酵时通气量影响试验结果

3 讨论

细菌的生长分为延迟期、对数期、稳定期、衰亡期4个时期。我公司生产的DY杆菌营养体繁殖主要在对数期，芽孢的形成在稳定期。改进工艺的目的是为了获得尽可能多的成熟芽孢。营养丰富、条件适宜、繁殖迅速，营养体自然多;营养体能处于同步生长状态，且能在最短时间内达到饥饿状态，这也是芽孢形成的关键。

图1细菌生长曲线显示，原工艺细菌生长繁殖速度较慢，达到最高浓度用时较长;而新工艺在培养基营养成分、通气效果方面较好，故繁殖速度快、代时短，且处于同步生长状态，能快速达到最高浓度，大大缩短了对数期时间，为整个运行周期的缩短奠定了基础。另外，原工艺细菌在稳定期的生长时间也较长，且活性有逐渐递减的趋势，这是因为该菌达到最高浓度时，菌龄差异较大，且培养基内有些营养成分仍很丰富，细菌有的继续生长繁殖，有的死亡溶解，待营养消耗殆尽时，才开始陆续形成芽孢，而此时代谢产物增多，抑制细菌生长成熟的有毒物质积聚，所以其芽孢形成率和活性都在降低;而新工艺既能满足对数期营养丰富、条件适宜的要求，又能满足稳定期营养不足对芽孢形成的促进作用，导致芽孢形成速率和形成率都更好。因此，新工艺更适合于菌体的繁殖和芽孢的形成，值得应用和推广。

对于新工艺，笔者中试了5批产品，无论从菌量还是活性上都高于原工艺;且对其菌粉进行了全面的生化反应鉴定，均符合菌种特性。在整个工艺改进过程中，未引入影响菌种诱变的因素，因此完全可以保证菌种的稳定性。另外，还通过追踪多批成品，发现产品活性的稳定取决于芽孢的形成率和成熟度，而这正是新工艺的优势所在，因此新工艺产品活性的稳定性毋庸置疑。

[1]吴铁林，白日彭，骆稽酉，等.地衣芽孢杆菌20 368株特性及其生态制剂的研究[J].中国微生物学杂志，1990，2(2):1－12.

[2]吴铁林，张剑君，白日彭，等.应用地衣芽孢杆菌调治肠道菌群失调的研究[J].解放军医学杂志，1989，14(3):199－201.

R915;TQ460.6

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1006－4931(2011)03－0032－02

2010－04－12;

2010－10－25)