反相高效液相色谱法测定苦豆子总碱中槐定碱含量＊

(广东医学院药学院，广东 东莞 523808)

苦豆子 Sophora alopecuroides L.为豆科槐属多年生草本植物，主要分布于我国西北荒漠地区，生态适应性强，资源丰富，其药用部位为可再生的地上部分，味苦性寒，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用，在民间广泛用于痢疾、肠炎等疾病[1]。苦豆子含有多种生物碱，其中苦参碱和槐定碱，槐果碱和苦豆碱，氧化苦参碱和氧化槐定碱，槐胺碱、新槐胺碱和异槐胺碱，3α－羟基槐定碱和脱氧槐定碱等均分别属于同分异构体，在不同条件下各成分间可能存在着生物转化等[2]，分离难度较大。目前国家药品标准对苦豆子总碱中槐定碱的含量测定方法所用色谱柱选择条件较为严格。笔者采用NH2柱建立了苦豆子总碱中槐定碱的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

HP－1100型高效液相色谱仪，G1315A型紫外－可见光二极管阵列检测器;超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);德国Sartorious CP225D型万分之一天平。槐定碱对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为110784－200303);苦豆子总碱(批号为20070212，宁夏盐池制药有限公司);乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Kromasil100－5NH2柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－ 磷酸水溶液(pH为2)－无水乙醇(80∶8∶10);检测波长:205 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃。理论板数按槐定碱峰计不得低于2 000。取对照品溶液和供试品溶液，用 0.45 μm 滤膜过滤，进样 20 μL，记录峰面积相应值，以外标法计算含量即可。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取槐定碱对照品5 mg，置50 mL量瓶中，用乙腈－无水乙醇(8∶1)流动相溶解并稀释至刻度，即得每1 mL含槐定碱对照品0.5 mg的对照品溶液。精密称取苦豆子总碱6 mg，用乙腈－无水乙醇(8∶1)流动相溶解，并定容至25 mL容量瓶中，得供试品溶液。取不含槐定碱的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取对照品10 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.415 g/L的对照品贮备液，置冰箱中备用。分别精密吸取 5，2.5，1.25，0.625，0.025 L 对照品贮备液，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取不同质量浓度的稀释液20 μL，进样测定。以峰面积对进样量(μg)进行线性回归，得回归方程 Y=3 460.5X+15.521，r=1.000(n=5)。结果表明，槐定碱进样量在0.02～8.3 μg范围内与峰面积线性关系良好。

重复性试验:精密吸取0.052 g/L的对照品溶液20 μL，连续进样 6 次。结果平均峰面积为 3 581.74，RSD=0.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重现性试验:取同一批样品，依法制备供试品溶液5份，进样测定。结果平均含量为42.93%，RSD=2.61%(n=5)，表明分析方法重现性良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液 20 μL，分别于 0，4，8，12，24，48，72 h 时进样，每次 20 μL。结果峰面积的 RSD=0.35%(n=7)，表明供试品溶液在72 h内稳定。

加样回收试验:精密量取已知含量的苦豆子总碱3 mg，分别加入一定量的对照品贮备液，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 槐定碱加样回收试验结果(n=5)

2.4 样品含量测定

取批号为070212的苦豆子总碱，依法制备供试品溶液并测定含量。结果3次测得的含量分别为43.3%，43.9%，41.0%，平均42.7%。

3 讨论

苦豆子总碱是从豆科槐属植物苦豆子的干燥全草或种子中提取的总生物碱。赵博光[3]报道，采用溶剂法提取，苦豆子总碱收率为1.55%，其中槐定碱收率为0.20%，苦参碱收率为0.06%，氧化苦参碱收率为0.006%，槐果碱收率为0.08%，槐胺碱收率为0.02%，苦豆碱收率为0.12%。槐定碱是苦豆子中含量较高的生物碱之一，占苦豆子总碱的20% ～60%，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗心律失常、保护心肌、提高正性肌力等作用，是苦豆子总碱的主要活性成分，因此以槐定碱作为苦豆子总碱的质量控制指标。目前苦豆子总碱的质量控制主要依据国家药品标准WS－10001(HD－1391)－2003，该标准规定须使用Spherisorb氨基柱进行苦豆子总碱中槐定碱的含量测定;文献报道测定克泻灵片中槐定碱的含量须用Hypesil SiO2柱，流动相为乙醇－含0.01%二乙胺的甲醇溶液－正己烷(35∶35∶30)[4]。以上两种文献均对色谱柱有较严要求，特定型号的色谱柱限制了测定方法的应用。笔者曾采用瑞典Kromasil 100－5 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、依利特公司 Hypersil ODS 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、安捷伦公司 Zorbax SB C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)等多种色谱柱及甲醇－水、乙腈－水、乙腈－醋酸铵等不同流动相，结果获得的图谱效果欠佳。但C18柱子应用较多，建议以后继续深入研究。后采用Kromasil 100－5NH2柱，分别以甲醇－正己烷－冰醋酸、甲烷－正己烷－磷酸、甲醇－正己烷－氨水为流动相，结果以乙腈－磷酸水溶液(pH为2)－无水乙醇(80∶8∶10)为流动相分离效果好[5]。采用甲醇直接提取供试品，所含杂质太多;用氯仿直接提取供试品，提取不完全。笔者采用WS－10001(HD－1391)－2003标准测定方法中的样品处理方法，操作简便，分离效果理想。本研究结果表明，采用Kromasil 100－5NH2柱所建立的方法分离度好，可用于苦豆子总碱中槐定碱的含量测定。

[1]洪 阁，刘培勋.槐属植物生物碱化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2005，36(5):783.

[2]牟新利，王武宝，巴 杭，等.中药苦豆子化学成分及生理活性的研究进展[J].新疆师范大学学报(自然科学版)，2005，24(1):45－51.

[3]赵博光.苦豆草生物碱的研究[J].药学学报，1989，15(3):1.

[4]蔡松涛，欧阳惠芳，罗 杰.克泻灵片中槐定碱的含量测定[J].中成药，2004，26(5):附 6－附 7.

[5]Zhao W， Song L， Deng H，et al.Hydration，erosion，and release behavior of guar－based hydrophilic matrix tablets containing total alkaloids of Sophora alopecuroides[J].Drug Dev Ind Pharm，2009，35(5):594－602.